Встречный иммуноэлектрофорез. Устройство для проведения иммуноэлектрофореза в геле Метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле

Принцип встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) заключается в одновременном движении в геле навстречу друг другу антигенов и антител под действием электрического тока.

В результате их специфического взаимодействия образуется линия преципитата. Метод сочетает простоту реакции диффузной преципитации в геле с высокой разрешающей способностью электрофореза. Хотя по чувствительности этот метод уступает методу флюоресцирующих антител и реакции непрямой гемагглютинации, однако для него не требуется люминесцирующих антител, люминесцентного микроскопа и эритроцитарного диагностикума.

ВИЭФ - качественный метод. Он отличается высокой специфичностью, прост в выполнении. Его можно применять для обнаружения бактериальных или вирусных антигенов в патологическом материале, органах лабораторных (биопробных) животных или объектах окружающей среды.

Материалы и оборудование . 1. Агароза А и В. 2. 0,05 М мединал- HCl буфер (pH 8,6). 3. Хлорид натрия. 4. Фосфат натрия двузамещенный. 5. Фосфат калия однозамещенный. 6. Хлорид калия. 7. Оксалат аммония. 8. Специфический бактериальный или вирусный антиген. 9. Камера для электрофореза. 10. Выпрямитель постоянного тока на 50 мА. 11. Термостат электрический суховоздушный. 12. Центрифуга лабораторная настольная.

Техника постановки . На стеклянную пластинку, установленную горизонтально, наливают 30 мл расплавленной 1%-й агарозы, приготовленной на мединал - HCl буфере (pH 8,6). После того как гель застынет, в нем пробойником вырезают два двойных ряда лунок диаметром 5 мм (по 8 лунок в каждом ряду); расстояние между двойными рядами составляет 30 мм. Из лунок удаляют гель, собирают в пробирку, растапливают над пламенем горелки и с помощью пастеровской пипетки вносят на дно лунок.

Со стороны катода помещают исследуемый материал, а со стороны анода - моноспецифическую сыворотку, но лучше моноклональные антитела (МКА) в объеме 0,035 мл. Например, для обнаружения пневмококка - антапневмококковую сыворотку, для выявления антигена вируса гриппа - противогриппозную и т. д.

Пластинку помещают в камеру для электрофореза таким образом, чтобы поролон, применяемый в качестве соединительного мостика между буферной системой и гелем-носителем, касался последнего. Электрофорез проводят при комнатной температуре при напряжении 140…150 В и силе тока 35 мА в течение 18…35 мин.

Контроль . Исследование материала в ВИЭФ на присутствие специфического антигена должно сопровождаться контролем с заведомо положительным материалом.

Обнаружение возбудителя при сочетании ВИЭФ с подращиванием . Для посева загрязненного материала следует использовать селективные среды.

После 36-часовой инкубации при 37 °С в чашку вносят 0,3 мл 0,85%-го раствора NaCl с 4 % формалина, делают смыв, который отсасывают в пробирку и после экспозиции в течение 1 ч исследуют в ВИЭФ.

Учет результатов . При положительном результате появляется линия прещшитата между лункой с исследуемым материалом и лункой со специфической сывороткой. Линия преципитата в зависимости от количества антигена в исследуемом материале может располагаться либо посередине расстояния между лунками, либо ближе к резервуару с сывороткой.

Обычно линии преципитата формируются через 18…35 мин после начала электрофореза.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится взамен метода, изложенного в ФС 42-3874-99

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для исследования антигенного состава биологических материалов, а также для определения чистоты, качественного и количественного состава иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) в агаровом геле, сочетающим методы зонального электрофореза и иммунодиффузию.

В процессе иммуноэлектрофореза в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью методов простой или двойной иммунодиффузии происходит реакция между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами. Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными маркерами.

Эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антисывороток, а также от их титра и сродства к антигенам.

Обычно иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитела, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего при встрече образуются линии (дуги) преципитации. Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена, его концентрации относительно антител (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную). Определенное соотношение концентраций антигена и антител, которое является оптимальным для образования преципитата называется зоной эквивалентности. При этом получаются четкие линии преципитации.

Концентрация (титр) антител в иммунной сыворотке также может значительно варьировать. Возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. Для подбора эквивалентного соотношения антиген-антитело иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить те или иные компоненты.

Метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле

Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 90х120 мм помешают строго горизонтально на предметный столик. Охлажденный до температуры (45±5) 0 С агаровый гель наносят на стеклянную пластину в количестве 18,0-20,0 мл. После застывания при комнатной температуре через 20-30 мин на пластине образуется агаровый слой толщиной 2,0 – 2,5 мм.

После застывания геля в нем по специальному трафарету вырезают 6-7 лунок диаметром 1-2 мм. Лунки заполняют испытуемым образцом в объеме, не превышающем объем лунки (по 2 лунки на каждый испытуемый образец). При этом в верхнюю и нижнюю лунки стеклянной пластинки с гелем вносят контрольный образец — нормальную сыворотку крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), окрашенный пиронином Б (или иным красителем, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации).

В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 500 мл веронал-мединалового или боратного буферного раствора, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Полученный раствор (или иной буферный раствор указанный в фармакопейной статье или нормативной документации) наливают в электродные секции камеры прибора для электрофореза.

Пластину с подготовленным гелем помещают в прибор для электрофореза и соединяют с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью нескольких слоев фильтровальной бумаги. В случае конструкции прибора для электрофореза, предусматривающей соединение агара на пластине с электродным буфером с помощью агаровых столбиков, пластину устанавливают в уравновешенный прибор и заливают расплавленным агаром до его соединения с агаровыми столбиками и образования слоя геля толщиной 1 – 2 мм.

Прибор для электрофореза накрывают крышкой и включают источник питания (напряжение 70-200 В, сила тока 10-40 мА). Электрофорез проводят в течение 1,5-3 ч до момента, когда пятно пиронина Б, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.

После проведения электрофореза с помощью специального трафарета между лунками в агаровом геле вырезают продольные «канавки» (параллельные направлению миграции). В «канавки» вносят по 0,25 мл преципитирующуей антисыворотки: против сывороточных белков крови человека (при проведении испытаний фракционного состава) или поливалентную сыворотку против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи (для подтверждения подлинности).

Пластину с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при температуре (5±3) 0 С в течение 24 — 48 ч.

Для отмывания белков, не вступивших в реакцию преципитации, пластину с агаром помещают в кюветы, заливают 0,9% раствором натрия хлорида и выдерживают в течение 16-18 ч. Раствор меняют 3-4 раза. Затем пластину извлекают из 0,9% раствора натрия хлорида, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида и высушивают на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку. После этого пластину с высушенным гелем накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида, не оставляя пузырьков воздуха, и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40°С. После высушивания пластинки фильтровальную бумагу смачивают водой и аккуратно удаляют.

Для окрашивания белков используют краситель амидочерный 10Б или другой пригодный краситель (в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), помещая пластину в кювету с красящим раствором на 30-40 мин. Затем пластину промывают в растворе для отмывки агара (2% раствор уксусной кислоты или иной раствор, в соответствии с указаниями в нормативной документации) в течение 15-40 мин до полного отсутствия окрашенного фона и снова высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40°С.

Липопротеиды окрашивают суданом черным В. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор, затем обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Следует проводить окрашивание полностью высушенного препарата, так как судан черный В нерастворим в воде и окрашивает влажный гель.

Учет результатов при исследовании фракционного состава препаратов иммуноглобулинов человека проводят визуально путем сравнения электрофореграммы испытуемого образца с электрофореграммой контрольного образца – нормальной сыворотки крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в нормативной документации), которая должна проявлять регламентированное количество линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека (не менее 15 линий преципитации при использовании «Стандартного образца тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза»). Основной компонент препарата иммуноглобулинов человека должен соответствовать иммуноглобулину G (Ig G) нормальной сыворотки крови человека.

Учет результатов при проведении исследований по подтверждению подлинности препаратов крови человека проводят визуально путем выявления линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи. Должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против сывороточных белков крови человека.

Примечания

1. Приготовление 0,05М веронал-мединалового буферного раствора (рН 8,6±0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,38 г веронала, 8,76 г мединала, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают до полного растворения.

1. Приготовление 0,05М боратного буферного раствора (рН 8,6±0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 6,7 г борной кислоты, 13,4 г натрия тетраборнокислого 10-водного, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают.
2. Приготовление 1,25% агарового геля . Приготовление агарового геля осуществляют одним из следующих способов:
3. Для приготовления 1,25% агарового геля используют 0,05М веронал-мединаловый буфер (рН 8,6±0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно, 2,76 г веронала и 17,52 г мединала на 1000 мл воды очищенной).
4. Для приготовления 1,25% агарового геля используют боратный буферный раствор (рН 8,6±0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно: 13,4 г борной кислоты и 26,8 г натрия тетраборнокислого 10-водного на 1000 мл воды очищенной).

В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл воды очищенной и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре (20±1) 0 C. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл, затем добавляют равный объем веронал-мединалового или боратного буферного раствора (или иного буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или в нормативной документации). Раствор агара фильтруют через 2-3 слоя марли, прибавляют тиомерсал до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40-50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным.

1. Приготовление красящего раствора амидочерного 10Б. Приготовление раствора красителя осуществляют одним из следующих способов:
2. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 450 мл 0,1М раствора уксусной кислоты, 550 мл 0,1М раствора натрия ацетата и перемешивают.
3. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 100 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Через 12 ч фильтруют через бумажный фильтр.
4. Приготовление красящего раствора судан черный В. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,2 г судана черного В, 20 мл 1М раствора натрия гидроксида, 380 мл воды очищенной и доводят объем раствора этанолом абсолютным до метки и перемешивают. Смесь непродолжительное время кипятят, охлаждают до комнатной температуры и после остывания краситель переливают в темную склянку с притертой пробкой. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.
5. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты для отмывки агара . В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 20,0 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.

Описание

Сыворотка для ИЭФ содержит антитела против белков сыворотки крови человека. В иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой крови человека препарат должен выявлять не менее 15 линий преципитации в соответствующих зонах: в a-зоне – альбумин, a 2 -макроглобулин; в β-зоне – трансферрин, церулоплазмин; в γ-зоне – линии IgG, IgА, IgМ и др.
Сыворотка должна полностью растворяться в течение 5 мин после добавления в ампулу (флакон) 1,0 мл воды очищенной. После растворения сыворотка должна быть прозрач¬ной, без осадка и посторонних включений, розова¬то-желтого цвета. Допустима небольшая опалесценция в проходящем свете.

Форма выпуска

Выпускается в ампулах по 1 мл (10 флаконов).

Состав

Сыворотка для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека сухая представляет собой лиофилизат иммунной сыворотки крови овец, иммунизированной нормальной сывороткой крови человека.
Набор состоит из сыворотки для иммуноэлектрофореза против сывороточных белков крови человека.

Сыворотка для ИЭФ против сывороточных белков крови человека. Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета 10 ампул (флаконов) по 1 мл

Показания для применения

Предназначена для качественного и количественного определения иммуноглобулинов и различных белков в сыворотке крови, других биологических жидкостях человека и препаратах крови методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ).

Режим дозирования и способ применения

Анализируемые образцы следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 сут или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать путем встряхивания. Повторное замораживание не допускается.

ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
Оборудование: прибор для иммуноэлектрофореза с выпрямителем электрического тока, весы аналитические, плитка электрическая, рН-метр, холодильник, предметный столик с регулируемым уровнем, пластины стеклянные (90 × 120) мм, влажная камера, мерная посуда, дозаторы пипеточные со сменными наконечниками, контейнер для обеззараживания.
Реагенты и материалы:
– агар;
– амидо черный 10Б;
– веронал;
– вода очищенная;
– глицерин;
– кислота борная;
– кислота уксусная;
– мединал;
– мертиолят (тимерозал);
– натрий тетраборнокислый 10-водный;
– натрия хлорид;
– пиронин Б;
– бумага фильтровальная лабораторная;
– перчатки одноразовые;
– дезинфицирующие растворы.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Иммуноэлектрофорез.
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с сывороткой для ИЭФ и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерную колбу на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.

Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.

Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.

Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора растворенной контрольной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенную сыворотку для ИЭФ. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 48 ч.

После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.


Окрашивание агара.
Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.

Учет результатов.
Учет результатов проводить визуально.

Иммуноэлектрофорез - один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитирующими АС, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения. В клинике этот метод чаще всего используется при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. В судебной медицине с его помощью анализируют системы гаптоглобина и группоспецифического компонента Gc.

В научно-исследовательской работе иммуноэлектрофорез служит основным методом идентификации белков, содержащихся в сложных смесях. Он незаменим как метод последовательного наблюдения за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов. Естественно, что метод, имеющий столь широкое применение, должен был видоизменяться и совершенствоваться в различных направлениях. Были предложены новые носители: гель агарозы, ПААГ, ацетат-целлюлозные пленки.

Вместе с тем ИЭФ стали комбинировать с различными методами специфического окрашивания и флюорохромироваиия, чтобы выявлять ферменты, углеводы, липопротеиды, нуклеопротеиды. В результате комбинации с другими методами анализа возникли диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, радиоиммуноэлектрофорез и др. Для количественного определения с помощью полиспецифических АС недавно был предложен двухмерный ИЭФ. Особая модификация двухмерного ИЭФ может повысить его чувствительность до уровня РИА. Это достигается электрофоретической элюцией антигена из малых стеклянных резервуаров объемом 0,1-10 мл. Для ИЭФ с охлаждением Виме сконструировал прибор, автоматически поддерживающий постоянную температуру и силу тока в процессе разделения.

Этот прибор очень удобен для определения электрофоретической подвижности различных веществ. Использование в этом приборе термоэлектрического охлаждения (батарея Пельтье) следует особенно рекомендовать в случае работы с ферментами и другими термолабильными веществами. Недавно был предложен простой способ разделения белков в двухмерном электрофорезе. Известен чувствительный способ определения непреципитирующих систем антиген-антитело, основанный на применении МКАТ, так называемый каскадный ИЭФ, включающий фиксацию АГ после электрофореза, присоединение к антигенам антител, удаление связанных антител и их количественная оценка.

В случае иммунофиксационного электрофореза разделяются AT, а не антиген. Это быстрый и экономичный метод, он особенно пригоден для массового обследования с целью выявления парапротеинемии и для получения препаратов белков. При ИЭФ нередко наблюдаются нарушения нормального течения процесса, и не всегда удается сразу обнаружить их причину. Если, например, используется недостаточно очищенный агар, но это чаще всего приводит к трем нарушениям: плохому образованию геля, сильному электросмосу, плохому обесцвечиванию препаратов. Недостаточно чистый агар всегда подлежит очистке. Приступая к работе с новой порцией агара, нужно сначала испытать его годность. Часто обнаруживается, что одни и те же антигены имеют разную электрофоретическую подвижность и по-разному окрашиваются при употреблении различных партий агара. Причиной нарушений при ИЭФ может быть гидролиз агара, вследствие многократного или слишком длительного нагревания.

О гидролизе свидетельствует ослабление гелеобразующих свойств и возникновение неровностей на поверхности геля. Электрофоретическое разделение может быть нарушено при использовании неподходящего буферного раствора. Большинство буферов служит хорошей питательной средой для бактерий и плесневых грибков. Поэтому запас буфера следует хранить в холодильнике или добавлять к нему консервант. Буфер, заполняющий электрофоретическую камеру, следует менять не реже одного раза в неделю. При многократном использовании электродного буфера необходимо после каждого разделения менять полюса электродов. Величина напряжения на клеммах камеры обычно не позволяет судить о физической силе тока, проходящего через гель, поэтому в цепь нужно последовательно включить миллиамперметр. В процессе разделения сила тока почти всегда повышается. Это явление обусловлено нагреванием геля, которое нарастает с увеличением продолжительности электрофореза.

Однако после первоначального подъема сила тока в цепи может упасть. Часто это происходит из-за подсыхания полосок фильтровальной бумаги, соединяющих гель с буфером, или даже из-за подсыхания самого геля. В этом случае следует уменьшить ионную силу буфера или напряжение на клеммах камеры. Кроме того, высыхание можно предотвратить, если перед электрофорезом обернуть пластинку геля и полоски бумаги полимерной пленкой. Удобнее всего работать с источником, который обеспечивает постоянную силу тока (стабилизация тока). Самой собой разумеется, что результаты ИЭФ зависят от качества антигенов и антисывороток.

Принцип действия и конструкция
Принцип действия прибора состоит в том, что антигены и антитела в электрическом поле обладают различной электрофоретической подвижностью.
Антигены, обладая электрофоретической подвижностью?-глобулинов, передвигаются в направлении положительного электрода - анода, в то время, как антитела, относясь к?-глобулинам, передвигаются в направлении отрицательного электрода - катода.
Взаимодействуя в эквивалентных соотношениях, антигены и антитела образуют в геле держателя неокрашенную, перпендикулярную к направлению тока в среде, линию преципитации, позволяющую судить о наличии или отсутствии антигена в исследуемой сыворотке.
Конструктивно прибор состоит из блока питания с выходным напряжением 30 В и 60 В, электрофоретической камеры на 26 проб, поддона, устройства заливки геля и нанесения лунок.

Порядок работы
Перед началом работы готовятся буферные растворы и агаровые гели в соответствии с рекомендациями, приведенными в описании прибора, закрепляется в горизонтальном положении держатель геля, после чего углубления держателя заполняются жидким гелем и выдерживаются до застывания геля.
Исследуемые сыворотки вносятся в гелевые лунки (до 25 проб одновременно плюс лунка с контрольной сывороткой стандартной тест-системы),
Определение антигенов проводится по методикам, приведенным в описании прибора, и в соответствии с выбранным режимом электрофореза.
Наличие или отсутствие линии преципитации, видимой при косом освещении, позволяет судить о наличии или отсутствии антигенов в исследуемой сыворотке.
В описании прибора приведены 4 методики определения антигенов и антител, а также идентификации антител в реакции истощения стандартного антигена.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Прибор обеспечивает одновременное обследование 26 проб, одна из которых - контрольная.
Время проведения реакции - не более 25 мин при определении антигена гепатита В
Габаритные размеры основных блоков, мм
блок питания 282 * 115 * 95
камера 87 * 69 * 223
поддон 264 * 120 * 37
Масса основных блоков, кг
Блок питания / камера / поддон 2,2 / 04 / 03
Номинальное напряжение и частота, В / Гц 220 / 50
Потребляемая мощность, В·А, не более 25
Средний срок службы прибора, лет 5

Вы можете обратиться за более детальной информацией к производителю "Прибор иммуноэлектрофореза ПИЭФ-01 - анализатор ИФА за 7200 руб.".