Среди штаммов escherichia coli есть патогенные. Кишечная палочка. Стандарты для пищевых продуктов
Genetika carries out scientific research in microbial and cell culture biotechnology mainly in the form of research projects requested by industry. Our results are available as patents, license and know-how. Since its foundation (1968) Genetika has been one of the most significant Russian research centers in microbial genetics and molecular biology and at the same time served as the main source of new strains and processes for Russian biotechnological industry.
Technologies developed in Genetika (threonine — 1979, riboflavin — 1991, acrylamide — 2000, phytase — 2008) are used all over the world by leading biotechnology companies. Governmental granted basic research as well as collaboration with other Russian and international research organizations helps to bridge the gap between applied and basic research. A range of interdisciplinary research projects is driving the innovative development forward. Now Genetika is ready to pursue the implementation of innovative research in industrial and social applications all around the world.more
|
New article in CELL by Genetika researchers Alex Mironov and Svetlana Eremina. Bacterial Nitric Oxide Extends the Lifespan of C. elegans (download the article) Ivan Gusarov, Laurent Gautier, Olga Smolentseva, Ilya Shamovsky, Svetlana Eremina, Alexander Mironov, Evgeny Nudler., ABSTRACT Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in multicellular organisms. Most animals produce NO from L-arginine via a family of dedicated enzymes known as NO synthases (NOSes). A rare exception is the roundworm Caenorhabditis elegans, which lacks its own NOS. However, in its natural environment, C. elegans feeds on Bacilli that possess functional NOS. Here, we demonstrate that bacterially derived NO enhances C. elegans longevity and stress resistance via a defined group of genes that function under the dual control of HSF-1 and DAF-16 transcription factors. Our work provides an example of interspecies signaling by a small molecule and illustrates the lifelong value of commensal bacteria to their host. |
 |
|
New review article "Microbial Producers of Butanol" (Download the article) O. V. Berezina, N. V. Zakharova, C. V. Yarotsky, and V. V. Zverlov Abstract—This review is written due to an increased interest in the production of energy carriers and basic substrates of the chemical industry from renewable natural resources. In this review, the microbiological aspects of biobutanol production are reflected and the microbial producers of butanol (both natural, i.e., members of the Clostridium genus, and recombinant), obtained by genetic modification of Clostridia and other microorganisms, are characterised. |
 |
Кишечная палочка (эшерихия коли , лат. ; общепринятое сокращение E. coli ) - вид грамотрицательных палочковидных бактерий, факультативных анаэробов, входящий в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.
Вид эшерихия коли (E. coli ) включён в род эшерихии (лат. Escherichia ), семейство энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae ), порядок энтеробактерии (лат. Enterobacteriales ), класс гамма-протеобактерии (лат. γ proteobacteria ), тип протеобактерии (лат. Proteobacteria ), царство бактерии.
Существует большое число разновидностей кишечной палочки (), в том числе, более 100 патогенных («энтеровирулентных») типов, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные, энтеротоксигенные, энтероинвазивные и . Морфологические различия между патогенными и непатогенными эшерихиями отсутствуют.
Кишечные палочки. Общие сведения
Кишечные палочки () устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях . Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.).
Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями. Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты - в течение 15 минут. Часть кишечных палочек имеет жгутики и подвижны. У других кишечных палочек жгутики и способность к движению отсутствуют.
Escherichia coli в кишечнике и кале человека
Число кишечных палочек среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1%, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки E. coli являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Кишечные палочки E.coli забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий . Кишечные палочки E. coli вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2 , В3 , В5, В6 , биотин , В9, B12, К, жирные кислоты (уксусную , муравьиную, а ряд штаммов также молочную , янтарную и другие), участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция.В кишечнике человека появляются в первые дни после рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 10 6 -10 8 КОЕ/г содержимого толстой кишки . В фекалиях здорового человека кишечные палочки (типичные) выявляются в количестве 10 7 -10 8 КОЕ/г, при этом количество лактозонегативных кишечных палочек не должно превышать 10 5 КОЕ/г, а гемолитические кишечные палочки должны отсутствовать.
Отклонения от указанных значений является признаком дисбактериоза:
- снижение типичных кишечных палочек до 10 5 -10 6 КОЕ/г, или повышение содержания типичных эшерихий до 10 9 -10 10 ; КОЕ/г определяется, как первая степень микробиологических нарушений
- повышение концентрации гемолитических кишечных палочек до 10 5 -10 7 КОЕ/г определяется, как вторая степень микробиологических нарушений
При избыточном росте кишечной палочки, как следствии дисбактериоза, кроме бактериофагов, при медикаментозной терапии применяются различные пробиотки (Бифидумбактерин , Лактобактерин , Ацилакт , Аципол и др.) и/или адекватные конкретному штамму e. coli и причине дисбактериоза антибиотики (у взрослых).
(кишечная палочка) - наиболее часто встречающийся возбудитель спонтанного бактериального перитонита - воспаления брюшной полости при отсутствие очевидного источника инфекции.
Энтеропатогенная кишечная палочка
Энтеропатогенная кишечная палочка часто обозначается аббревиатурой на латинице - ETEC. Кишечные инфекции, вызываемые энтеропатогенными штаммами кишечных палочек, развиваются чаще всего в тонкой кишке у детей первого года жизни, в том числе у новорождённых. Заболевание сопровождается сильным поносом с водянистым стулом без примеси крови, выраженными болями в животе, рвотой. Энтеропатогенные являются частой причиной диарей в родильных домах. Штаммы ETEC являются основной причиной развития острой водянистой диареи в развивающихся странах, особенно в теплый и влажный сезон. Как в развитых, так и в развивающихся странах штаммы энтеропатогенной кишечной палочки являются наиболее распространенной причиной «диареи путешественников », которая обычно проходит без лечения. Энтеропатогенная кишечная палочка имеет два важных фактора вирулентности:
- фактор колонизации, за счет которых происходит прилипание ETEC к энтероцитам тонкой кишки
- токсический фактор: штаммы ETEC продуцируют термолабильные (LT) и/или термостабильные (ST) энтеротоксины, вызывающие секрецию сока и электролитов, что приводит к водянистой диарее. ETEC не разрушают кисточковую кайму и не внедряются в слизистую оболочку кишечника
Энтеротоксигенная кишечная палочка
Энтеротоксигенные кишечные палочки обладают способностью прикрепляться к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкой кишки и продуцировать токсины, вызывающих диарею. Энтеротоксигенные кишечные палочки являются основной причиной острых диарей у детей и взрослых и частой причиной так называемой «диареей путешественников».Энтерогеморрагическая кишечная палочка
Энтерогеморрагические кишечные палочки (EHEC) являются причиной геморрагического колита , а также тяжелого заболевания - гемолитико-уремического синдрома (микроангиопатической гемолитической анемии, сочетающейся с почечной недостаточностью; аббревиатура ГУС или HUS).Для геморрагического колита характерно острое начало в виде сильных спастических болей в животе и водной диареи, которая вскоре становится кровавой. Лихорадка обычно отсутствует, но у некоторых температура тела может достигать 39 °С. В легких случаях геморрагический колит продолжается 7–10 дней. Приблизительно в 5 % случаев геморрагический колит осложняется геморрагическим синдромом, острой почечной недостаточностью и гемолитической анемией.
Источником инфекции мая 2011 года в Германии и других европейских странах являлся штамм продуцирующей шига-токсин STEC (синоним: продуцирующей веротоксин - VTEC) энтерогеморрагической кишечной палочки.
Заражение STEC или VTEC-кишечной палочкой происходит чаще всего через продукты питания или при близком контакте с больными людьми или животными. Для начала заболевания достаточно небольшого числа STEC/VTEC .
Установлено, что возбудителем европейской инфекции мая 2011 года является кишечная палочка серологической группы E. coli O104 (серотип E. coli O104:H4), имеющая в своем геноме ген, ответственный за продукцию шига-подобного токсина 2-го типа. В отличие от классических энтерогеморрагических кишечных палочек (E. coli О157:Н7), штаммы E.coli O104:H4 не имеют еае-гена, ответственного за продукцию белка интимина, который является фактором адгезии.
Штаммы E. coli O104:H4, выделенные от пациентов, характеризовались резистентностью к бета-лактамным антибиотикам за счет продукции бета-лактамазы расширенного спектра, но оставались чувствительными к группе аминогликозидов (гентамицин) и фторхинолонам.
После заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой инкубационный период длится чаще всего от 48 до 72 часов, но может быть и от 1 до 10 дней. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. Могут наблюдаться лихорадка и рвота. Большинство больных выздоравливают в течение 10 дней. Иногда инфекция может приводить к опасным для жизни состояниям, таким как гемолитико-уремический синдром.
Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуцентов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин - введена неконьюгативная, немобилизуемая плазмида p Сolap, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Полученный штамм лишен нежелательного адгезивного фенотипа инактивированием гена адгезина fimH пилей 1-го типа интеграцией гена устойчивости к канамицину - неомицину npt. Штамм E.coli М17 fim H::Kan/p Colap депонирован в ВКПМ под номером В-7448, Это позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Введенные в сконструированный штамм признаки стабильно сохраняются в популяции. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 4 ил., 1 табл.
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243]. В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52-54]. Однако, в отличие от исходного штамма штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л.Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16]. Другим недостатком штамма Е.coli М17 и его предшественника является наличие у них высокоадгезивного М н фенотипа фимбрий 1-го типа, необычного и нежелательного для кишечного штамма. Такой фенотип часто обнаруживается у выделяемых из макроорганизма штаммов при инфекции мочевыводящих путей и внутрибольничной пневмонии [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е. coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения. Задачей изобретения является создание штамма Е.coli - производного E.coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е. coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, нежелательный адгезивный фенотип, чувствительность к антибиотикам. Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью, сниженной способностью к колонизации отличных от первичной интестинальной ниш в макроорганизме и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда. Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap, который продуцирует колицин E1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл) и содержит инактивированный ген fimH, кодирующий фимбриальный адгезин. Штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7448. В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что инактивирование гена адгезина fimH пилей 1-го типа в геноме Escherichia coli штамма М17 и введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина E1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат со сниженной способностью к колонизации отличных от интестинальной ниш, с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется чертежами, где: на фиг. 1 показана схема получения рекомбинантного штамма E. coli M17fimH::kan/pColap с дефектом в гене адгезина fimH пилей 1-го типа, на фиг. 2 - схема конструирования гибридной плазмиды pColap, на фиг. 3 приведены результаты исследования адгезивной активности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, на фиг. 4 - результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap. При получении штамма Е.coli М17 fimH::kan/pColap в качестве исходного использовали его ближайший аналог - штамм Е.coli М17. Для элиминации фимбриального адгезина, сообщающего клеткам Е.coli М17 нежелательный высокоадгезивный М н фенотип, получали рекомбинантный штамм, у которого в хромосомный ген fimH, кодирующий адгезин, был интегрирован ген устойчивости к канамицину-неомицину npt. С этой целью использовали плазмиду pCH103, производную плазмиды R6K, которая имеет pir-зависимую систему репликации и может поддерживаться только в штаммах, содержащих ген pir, обеспечивающий ее репликацию [Сокуренко Е.В., Чеснокова В.Л. "Способ модификации адгезивного фенотипа диких изолятов Е.coli в применении к штаммам - продуцентам препарата колибактерин". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, Том 124, N 9, с. 334 - 338]. Плазмида pCH103 несет ген устойчивости к ампициллину и фрагмент хромосомы, содержащий гены fim-кластера, в котором целостность гена fimH нарушена вставкой гена устойчивости к канамицину (неомицину) npt. После трансформации ее в штамм Е.coli М17 она не может поддерживаться в клетках, и устойчивые к канамицину трансформанты могут возникать или при интеграции ее целиком в хромосому в результате одного кроссинговера или в результате двойного кроссинговера (фиг. 1). Трансформанты второго класса остаются чувствительными к ампициллину. Среди них был отобран штамм, обозначенный Е.coli M17fimH::kan (или М17 fimH::npt). Проведенное исследование подтвердило отсутствие у полученного штамма маннозо-чувствительной адгезии, т.е. FimH - фенотип. Для повышения антагонистической активности штамма Е. coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина E1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1, эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез - лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена - лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5" - участке, повышающем эффективность экспрессии , произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap. Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации -лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е. coli М17 fimH::kan и получили штамм Е.coli М17 fimH::kan/pColap. Штамм имеет следующие характеристики. Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера. Через 36 ч роста при 37 o C образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируются. Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%). Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями. Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера. Через 18-24 ч роста при 37 o C наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах. Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %). Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах слабый или отсутствует. Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом. Отношение к температуре и pH среды. Хорошо растет при температуре от 30 до 42 o C и при pH 6,8 - 7,2. Биохимические свойства. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает. Отношение к антибиотикам. Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л. Продукция бактериоцинов. Продуцирует колицин E1. Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина E1. Штамм имеет антигенную формулу О2:L1:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000. Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования. Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина (табл. 1). Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37 o C с аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10 -7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6 % агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена - лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17 fimH::kan/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину. Пример 2. Исследование адгезивных свойств и определение адгезивного фенотипа штамма Е. coli М17 и его производных. Адгезивный фенотип определяли стандартным методом "исследования роста" . Из свежей культуры исследуемых штаммов бактерий готовили суспензию бактериальных клеток в физиологическом растворе с оптической плотностью 1.0 при длине волны 540 нм. Параллельно приготовили планшеты для микротитрования с плоскодонными лунками с иммобилизованными в лунках субстратами для адгезии, а именно: МН (дрожжевой маннан), РН (бычья РНКаза В) и БСА (бычий сывороточный альбумин). Затем бактериальную суспензию помещали в лунки и инкубировали в течение 40 мин. Несвязавшиеся бактериальные клетки тщательно отмывали физиологическим раствором. В лунки добавляли богатую питательную среду и инкубировали с постоянным перемешиванием при 37 o C в течение 2,5 - 3 ч до появления помутнения в лунках. Оптическая плотность в каждой лунке учитывалась на автоматическом ридере микропланшет (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, Calif., USA). В данном эксперименте исследовались следующие штаммы Е.coli: М17 - исходный штамм; М17 fimH::kan - штамм М17 с инактивированным геном адгезина fimH: М17 fimH: : kan/pPKL91 - штамм fimH::kan, трансформированный плазмидой pPKL91, содержащей регуляторный ген fimB, включающий экспрессию пилей 1-го типа бактериальной клеткой; штамм M17fimH::kan/pColap - штамм М17 fimH::kan, трансформированный сконструированной нами плазмидой pColap, несущей детерминанты устойчивости к ампициллину и продукции колицина Е1. Результаты исследования адгезивной активности штаммов Е.coli М17 и производных штамма Е.coli М17, оцененной с помощью метода "исследования роста", представлены на фиг. 3 (по оси ординат отложены значения оптической плотности при длине волны 540 нм; на оси абсцисс - исследуемые штаммы Е. coli: 1 - М17; 2 - М17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - М17 fimH::kan/pColap). Как видно из фиг. 3, исходный штамм Е. coli М17 хорошо связывается и с РНКазой B, и с маннаном, что указывает на МН адгезивный фенотип, нежелательный для интестинального штамма кишечной палочки. Полученный нами рекомбинантный штамм М17 fimH::kan проявляет нулевую адгезивную активность как сам по себе, так и после введения в него плазмиды, включающей экспрессию пилей 1-го типа. Нулевая адгезиная активность сохраняется в этом штамме и после введения в него плазмиды pColap (штамм М17 fimH::kan/pColap). Пример 3. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17 fimH::kan/pColap, детерминируемых плазмидой pColap. Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков. Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColE1, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColE1, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид. Культуры штаммов М17 fimH::kan/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37 o C в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10 o бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10 6) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали, как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента. Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. "Эксперименты в молекулярной генетике", М. , "Мир", 1976, стр. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6 % агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37 o C в течение 3 - 4 ч, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 с и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3 - 5 мл полужидкого (0,7 %) агара, содержащего 10 7 /мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37 o C. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину). Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях. Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны, гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17 rimH::kan/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.
Формула изобретения
Штамм бактерий Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap ВКПМ В-7448, используемый для получения пробиотического препарата.
Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине, конкретно к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург, а также для получения специфических антител к вирусу Марбург и генно-инженерных вакцин против вируса Марбург
Расшифровка генома EHEC показала, что поразившая Европу кишечная инфекция вызвана ранее не встречавшимся штаммом бактерии - "высокозаразным и токсичным". Число зараженных не снижается, выявлены два случая заболевания в США, все следы ведут на север Германии, источник инфекции пока не найден. Реабилитированные испанские фермеры требуют компенсаций, убытки грозят всему ЕС: Россия запретила импорт овощей из Европы. Москва делает из мухи слона, возмущаются европейцы.
Штамм E. coli, вызвавший беспокойство по всей Европе, - ранее неизвестная "супертоксичная" разновидность этой бактерии, сообщает The New York Times, ссылаясь на заявления чиновников и экспертов в четверг.
"Насколько мы понимаем, этот штамм никогда прежде не выявлялся в условиях вспышки инфекции", - заявил Грегори Хартль, официальный представитель ВОЗ. О случаях этого заболевания сообщили на данный момент 10 стран, но практически все следы ведут на север Германии, пишет издание.
Инфекция вызвана "новым штаммом бактерии - высокозаразным и токсичным", сказано в заявлении Пекинского института геномики, который сотрудничает с немецкими учеными из Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф. Китайские исследователи заключили, что новый штамм похож на бактерию EAEC 55989, которая встречается в Центрально-Африканской Республике и вызывает сильную диарею.
"Ситуация все еще напряженная. В начале недели мы надеялись, что число зараженных начнет снижаться, но этого не произошло", - сказал директор центра Гамбург-Эппендорф Йорг Дебатин. По словам его коллеги, бактериолога Холгера Роде, китайская лаборатория заключила, что новый штамм является гибридом и дает острое, потенциально летальное осложнение - гемолитико-уремический синдром. "Гены нового штамма примерно на 80% совпадают со штаммом O104, а остальные 20% восходят к другим, более токсичным бактериям", - пересказывает газета слова Роде. Ранее Европейский центр предотвращения и контроля заболеваний ЕС и другие европейские ведомства заявляли, что вспышка вызвана редким штаммом E. coli - O104:H4.
По данным ВОЗ, Швеция сообщила о 28 заболевших, Дания - о 7, Франция - о 6 и т.д. Почти все эти люди недавно побывали на севере Германии, а один имел контакт с приезжим оттуда.
Вспышка инфекции все более сказывается на политической жизни Европы и ее экономических связях, отмечает газета. Так, если Россия будет жестко соблюдать эмбарго на ввоз овощей, европейские фермеры окажутся в еще более тяжелом положении, лишившись одного из крупнейших рынков сбыта.
"В поисках эффективных способов борьбы с опасной кишечной инфекцией врачи сделали важный шаг вперед, - сообщает немецкая Frankfurter Allgemeine Zeitung. - Теперь расшифрован геном EHEC, и специалисты ищут уязвимые места своего врага". В Германии между тем инфекция продолжает бесчинствовать - от ее последствий скончались 17 человек. Всего в Германии зафиксировано около 2 тыс. случаев заболевания кишечной палочкой штамма EHEC. По данным ВОЗ, случаи заболевания зарегистрированы уже в десяти странах Европы.
Эксперты Университетской клиники Гамбург-Эппендорф в сотрудничестве с китайскими коллегами расшифровали геном бактерии, установив, что речь идет о ранее не встречавшемся гибриде энтеробактерий, вызывающих так называемый гемолитико-уремический синдром.
Между тем, говорится в статье, Испания требует миллионной компенсации за ущерб, причиненный ее сельскому хозяйству в результате поспешных заявлений Германии.
Тем временем по меньшей мере два случая инфицирования кишечной палочкой выявлены в США, сообщает The Washington Post. Оба заболевших были госпитализированы в мае с серьезным синдромом, вызываемым микробом, после возвращения из Гамбурга, где, предположительно, они были заражены. Чиновники ожидают результатов лабораторных анализов, чтобы подтвердить диагноз.
"Дональд Крэмер, заместитель руководителя отдела FDA по контролю продуктов питания, заявил, что агентство изучает продукцию, прибывающую из Испании и других стран, где распространилось заболевание", - пишет автор статьи Линдси Лейтон.
Филипп Тарр, специалист по кишечной палочке с кафедры медицины Вашингтонского университета в Сент-Луисе, полагает, что вспышка вряд ли достигнет Соединенных Штатов, потому что бактерия не содержится в продуктах питания, поставляемых на американский рынок. Хотя она может передаваться от человека к человеку, чаще она вызывается зараженной пищей.
Однако если бы бактерия, погубившая 18 человек в Европе, поразила фрукты и овощи, выращиваемые в США, предотвратить вспышку было бы невозможно, потому что от американских производителей не требуют проверки продуктов питания на этот болезнетворный микроорганизм перед их попаданием в супермаркеты. По признанию специалистов, американская нормативно-правовая база в этом вопросе "отстает на пару шагов". При этом регулирующие органы США концентрируются в основном на более известной версии кишечной палочки, E.coli 0157. Штамм, поразивший свыше 1600 человек в Европе, является особо опасной версией микроорганизма, E. Coli 0104, пишет издание.
Из страха перед кишечной палочкой Россия запретила ввоз овощей из ЕС, рассказывает The Financial Times. Глава Роспотребнадзора Геннадий Онищенко заявил, что запрет вступает в силу немедленно и таможенникам приказано заблокировать импорт, особенно из Германии и Испании.
По данным Freshfel, Россия - крупнейший рынок экспорта для европейских производителей овощей. 34% овощей, ввозимых в Россию, - европейские, в основном из Польши и Голландии.
Глава Еврокомиссии по здравоохранению и защите потребителей Паола Тестори Коджи написала в ответ Онищенко "письмо в жестких выражениях", призвав снять "необоснованные ограничения". "Я считаю такие меры диспропорциональными, не обоснованными научно и, следовательно, не соответствующими принципам [международных] соглашений [о торговле]", - цитирует издание ее письмо.
Решение Кремля - признак того, что вспышка инфекции рискует вызвать массовую панику, замечает газета. Европейские эксперты до сих пор не выявили источника E. coli.
Россия не впервые принимает столь жесткие решения, отмечает El Mundo, напоминая о газовом кризисе 2009 года, когда Москва прижала Европу к стенке. На этот раз, по словам профессора Европейского института при Лондонской школе экономики (LSE) Йена Бегга, Россия продемонстрировала "инстинктивную реакцию, носящую скорее популистский, нежели научно обоснованный характер". Возможно, дело в надежде получить дивиденды на предстоящих выборах или в русской привычке делать из мухи слона, но российские аргументы не знают полутонов, пишет издание.
Еврокомиссия осудила чрезмерную реакцию России, предупредив, что потребует объяснений, однако все эти предупреждения могут остаться словами, несмотря на тяжелые экономические последствия такой блокады. "Учитывая, что Россия не входит в ВТО, а нам нужно импортировать ее газ, ответные меры будут затруднены", - приводит газета мнение Бегга.
Кишечная палочка (эшерихии) в организме человека в норме заселяет весь пищеварительный канал. Выделяют различные штаммы (виды) кишечной палочки, которые выполняют полезные функции в организме. Однако некоторые агрессивные разновидности могут вызвать заболевание у детей и взрослых.
Кишечную палочку (эшерихию) новорожденный получает с молоком матери и при непосредственном контакте с окружающими людьми в первые сутки от момента рождения. На протяжении всей жизни определенные штаммы кишечной палочки постоянно присутствуют на поверхности слизистой кишечника, выполняя определенные полезные функции. Это так называемые комменсалы – обязательные представители собственной .
При нарушении гигиенических моментов в организм человека проникают патогенные виды кишечной палочки, которые вызывают симптом различных заболеваний.
Непатогенные кишечные палочки
Эшерихии в пищеварительном канале выполняют определенные функции:
- препятствуют заселению слизистой ЖКТ (микробный антагонизм);
- участвуют в синтезе витаминов группы В и К;
- обеспечивают процессы расщепления, всасывания и переваривания некоторых пищеварительных веществ.
Большое значение играет не только факт присутствия непатогенных штаммов кишечной палочки внутри пищеварительного канала человека, но и ее количество. При снижении количества эшерихий ниже допустимого уровня отмечается ухудшение всех вышеописанных процессов. При затянувшемся процессе формируется – нарушение микробного соотношения в пищеварительном канале.
Определить качественный и количественный в целом и кишечной палочки в частности можно с помощью развернутого бактериологического исследования (так называемый ) и .
Патогенные виды кишечной палочки
Среди патогенных штаммов кишечной палочки выделяют:
- энтеропатогенные;
- энтеротоксигенные;
- энтероинвазивные;
- энтерогеморрагические.
Для каждой группы характерна определенная клиническая симптоматика.
Источником инфекции при эшерихиозе может быть как больной человек, так и инфицированное животное. Среди возможных путей передачи на первом месте стоит пищевой, после него контактный и водный.
Энтеропатогенные виды кишечной палочки вызывают развитие (поражения тонкой и толстой кишки) у детей раннего возраста (в том числе и первого года жизни). Источником инфекции является взрослый человек (родственники или чаще всего медицинский персонал), наибольшую значимость имеет так называемый носитель. Передача инфекции осуществляется контактно-бытовым путем (через предметы обихода и медицинский инструментарий).
Энтероинвазивные виды кишечной палочки вызывают острые кишечные нарушения у детей более старшего возраста и у взрослых людей. Источником инфекции также является человек, ведущий путь передачи – пищевой. Среди возможных пищевых факторов передачи инфекции наиболее значимы:
- молочные продукты (кефир, ряженка, творог, простокваша);
- разнообразные салаты;
- мясные продукты (студень, холодец);
- напитки, не подвергающиеся термической обработке (квас, компот, соки в нестерильной таре).
Энтеротоксигенные разновидности кишечной палочки вызывают кишечные расстройства у детей дошкольного возраста. Наиболее распространены в странах с тропическим и субтропическим климатом, поэтому рассматриваются как возможный возбудитель так называемой . Наиболее характерный путь передачи – водный, так как для развития клинической симптоматики необходимо проникновение в организм человека достаточно большой дозы патогенного варианта кишечной палочки.
Энтерогемолитические разновидности кишечной палочки изучены меньше. Вызывают поражение пищеварительного канала у взрослых людей. Предполагаемый источник инфекции – крупный рогатый скот, а возможные факторы передачи – продукты животного происхождения, не проходящие достаточную термическую обработку (мясо с кровью, непрожаренный шашлык, молоко некипяченое).
Факторы размножения и роста
Размножению и росту бактерий способствует любая погрешность в выполнении санитарно-гигиенических правил:
- недостаточно тщательное мытье рук;
- употребление сырой водопроводной или колодезной воды;
- неправильное мытье посуды, овощей и фруктов (холодной водой, без моющего средства и без щетки);
- редкая смена нательного и постельного белья.
Все это приводит к попаданию кишечной палочки в пищеварительный канал и другие системы органов. Это вызывает развитие нарушений и тяжелых заболеваний репродуктивной и мочевыделительной сферы, а также нервной системы.
Симптомы заболеваний, вызываемых кишечной палочкой
Если патогенная кишечная палочка проникает в пищеварительный канал человека, то наблюдается такая клиническая симптоматика:
- продолжительная тошнота и повторные эпизоды рвоты;
- боль в животе умеренной интенсивности и разлитого характера;
- жидкий стул, иногда с примесью крови и слизи (при поражении инвазивными штаммами);
- ухудшение общего состояния (повышение температуры тела, слабость, снижение аппетита).
При поражении мочевыделительного тракта и репродуктивной сферы клинические проявления неспецифичны: доминирует болевой синдром. Кишечная палочка наиболее опасна, если попадает в кровь или центральную нервную систему. В этом случае развивается заражение крови (сепсис) или менингит (менингоэнцефалит). Развиваются тяжелые нарушения функций внутренних органов, которые могут привести к смерти больного.
Варианты обнаружения бактерии
Присутствие кишечной палочки допустимо только в пищеварительном канале. Можно даже сказать, что эшерихия обязательно должна выделяться из пищеварительного тракта здорового человека.
В других биологических жидкостях (кровь, моча, вагинальный секрет, мазок из уретры) кишечная палочка отсутствует.
Если кишечная палочка обнаружена в моче или вагинальном секрете (мазке из уретры), то следует повторить исследование. Вполне возможно, что сбор биологического материала был проведен с нарушениями: недостаточно тщательно помытые руки и половые органы или нестерильный контейнер. Если и при повторном обнаруживается эшерихия, то это свидетельствует о патологическом процессе. Как правило, наблюдаются и другие признаки воспалительных изменений. Лечение необходимо в соответствии с выраженностью клинических проявлений.
Худший вариант – обнаружение кишечной палочки в крови или спинномозговой жидкости. Это признак тяжелой генерализованной инфекции, требующий немедленного комплексного лечения.
Лечение
Лечение кишечной палочки зависит от локализации патологического процесса. Непосредственное воздействие на патогенный штамм эшерихии оказывают