Применение иммунологических реакций в медицинской практике. Классификация иммунологических реакций. Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике

Основными элементами иммунной системы организма являются белые клетки крови – лимфоциты, существующие в двух формах. Обе формы происходят из клеток-предшественников в костном мозге, т.н. стволовых клеток. Незрелые лимфоциты покидают костный мозг и попадают в кровяное русло. Некоторые из них направляются к тимусу (вилочковой железе), расположенному у основания шеи, где происходит их созревание. Прошедшие через тимус лимфоциты известны как Т-лимфоциты, или Т-клетки (Т от «тимус»). В экспериментах на цыплятах было показано, что другая часть незрелых лимфоцитов закрепляется и созревает в сумке Фабрициуса – лимфоидном органе около клоаки. Такие лимфоциты известны как В-лимфоциты, или В-клетки (B от bursa – сумка). У человека и других млекопитающих В-клетки созревают в лимфатических узлах и лимфоидной ткани всего организма, эквивалентных сумке Фабрициуса у птиц.

Оба типа зрелых лимфоцитов имеют на своей поверхности рецепторы, которые могут «узнавать» специфический антиген и связываться с ним. Контакт В-клеточных рецепторов со специфическим антигеном и связывание определенного его количества стимулируют рост этих клеток и последующее многократное деление; в результате образуются многочисленные клетки двух разновидностей: плазматические и «клетки памяти». Плазматические клетки синтезируют антитела, выделяющиеся в кровоток. Клетки памяти являются копиями исходных В-клеток; они отличаются большой продолжительностью жизни, и их накопление обеспечивает возможность быстрого иммунного ответа в случае повторного попадания в организм данного антигена.

Что касается Т-клеток, то при связывании их рецепторами значительного количества определенного антигена они начинают секретировать группу веществ, называемых лимфокинами. Некоторые лимфокины вызывают обычные признаки воспаления: покраснение участков кожи, местное повышение температуры и отек за счет увеличения кровотока и просачивания плазмы крови в ткани. Другие лимфокины привлекают фагоцитирующие макрофаги – клетки, которые могут захватывать и поглощать антиген (вместе со структурой, например бактериальной клеткой, на поверхности которой он находится). В отличие от Т- и В-клеток эти макрофаги не обладают специфичностью и атакуют широкий спектр разных антигенов. Еще одна группа лимфокинов способствует разрушению инфицированных клеток. Наконец, ряд лимфокинов стимулирует добавочное количество Т-клеток к делению, что обеспечивает быстрое возрастание числа клеток, которые отвечают на тот же антиген и выделяют еще больше лимфокинов.

Антитела, вырабатываемые В-клетками и поступающие в кровь и другие жидкости организма, относят к факторам гуморального иммунитета (от лат. humor – жидкость). Защита организма, осуществляемая с помощью Т-клеток, называется клеточным иммунитетом, так как в ее основе лежит взаимодействие отдельных клеток с антигенами. Т-клетки не только активируют другие клетки путем выделения лимфокинов, но и атакуют антигены с помощью содержащих антитела структур на поверхности клетки.

Антиген может индуцировать оба типа иммунного ответа. Более того, в организме происходит определенное взаимодействие между Т- и В-клетками, причем Т-клетки осуществляют контроль над В-клетками. Т-клетки могут подавлять B-клеточный ответ на безвредные для организма чужеродные вещества или, наоборот, побуждать В-клетки вырабатывать антитела в ответ на вредные вещества с антигенными свойствами. Повреждение или недостаточность данной контролирующей системы может проявляться в виде аллергических реакций на вещества, обычно безопасные для организма.

Этапы иммунной реакции

Иммунную реакцию от начала до завершения можно разделить на три этапа:

Распознавание антигена;
формирование эффекторов;
эффекторная часть иммунного ответа.

Основу теории специфического распознавания антигенов составляют следующие постулаты:

1. На поверхности лимфоцитов присутствуют специфические антигенсвязывающие рецепторы, которые экспрессируются вне зависимости от того, встречался ли ранее организм с данным антигеном.

2. Каждый лимфоцит имеет рецептор только одной специфичности.

3. Антигенсвязывающие рецепторы экспрессируются на поверхности как Т-, так и В-лимфоцитов.

4. Лимфоциты, наделенные рецепторами одной специфичности, являются потомками одной родительской клетки и составляют клон.

5. Макрофаги осуществляют презентацию антигена лимфоциту.

6. Распознавание «чужого» напрямую связано с распознаванием « своего », т.е. антигенсвязывающий рецептор лимфоцита распознает на поверхности макрофага комплекс, состоящий из чужеродного антигена и собственного антигена гистосовместимости (МНС).

В состав молекулярного аппарата антигенного распознавания входят антигены главного комплекса гистосовместимости, антигенсвязывающие рецепторы лимфоцитов, иммуноглобулины, молекулы клеточной адгезии.

К основным этапам антигенного распознавания относятся:

Неспецифический этап;
распознавание антигена Т-клетками;
распознавание антигена В-клетками;
клональная селекция.

Неспецифический этап

Макрофаг первым вступает во взаимодействие с антигеном, осуществляя филогенетически самую древнюю разновидность иммунной реакции. Антиген подвергается фагоцитозу и перевариванию, результатом которого является «разборка» крупных молекул на составные части. Этот процесс называется «процессингом антигена». Затем процессированный антиген экспрессируется в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости на поверхности макрофага.

Распознавание антигена Т- клетками. Т - хелпер распознает комплекс, состоящий из чужеродного антигена и собственного антигена МНС. Для иммунного ответа необходимо одновременное распознавание как чужеродного антигена, так и собственного антигена МНС.

Распознавание антигена В- клетками. В- лимфоциты распознают антигены посредством своих иммуноглобулиновых рецепторов. Антиген также может подвергаться повторному процессингу при взаимодействии с В-лимфоцитом. Процессированный антиген помещается на поверхность В- клетки, где он распознается активированным Т - хелпером. В- лимфоцит не способен к самостоятельному ответу на антигенную стимуляцию, поэтому ему необходимо получить второй сигнал от Т -хелпера. Антигены, иммунная реакция на которые возможна только с таким повторным сигналом, называются тимусзависимыми. Иногда активация В - лимфоцитов возможна и без участия Т - клеток. Бактериальный липополисахарид в высоких концентрациях вызывает активацию В - лимфоцитов. При этом специфичность иммуноглобулиновых рецепторов В - лимфоцита не имеет значения. В данном случае собственная митогенная активность липополисахарида исполняет роль второго сигнала для В - лимфоцитов. Такие антигены называют тимуснезависимыми антигенами типа I. Некоторые линейные антигены (полисахариды пневмококков, поливинилпирролидон и др.), также стимулируют В- клетки без участия Т - лимфоцитов. Эти антигены длительное время остаются на мембране специализированных макрофагов и называются тимуснезависимыми антигенами типа II.

Клональная селекция

При попадании в организм антигена происходит селекция клонов с рецепторами, комплементарными данному антигену. Только представители этих клонов участвуют в дальнейшей антигензависимой дифференцировке клона В-лимфоцитов.

Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов.

Взаимодействие между клетками в процессе формирования иммунного ответа на антигенную стимуляцию осуществляется за счет особых растворимых медиаторов - цитокинов. Под воздействием различных цитокинов, продуцируемых макрофагами либо Т-лимфоцитами, происходит созревание В-лимфоцитов в антителообразующие клетки.

Для В- лимфоцитов конечным этапом дифференцировки является преобразование в плазматическую клетку, которая продуцирует огромное количество антител. Специфичность этих антител соответствует специфичности иммуноглобулинового рецептора В- лимфоцита -предшественника.

После того, как эффекторное звено иммунной реакции сформировано, наступает ее третий этап. На завершающем этапе иммунного ответа задействованы антитела, система комплемента, а также цитотоксические Т-лимфоциты, осуществляющие цитотоксическую реакцию.

Комплекс микроорганизма с антителом запускает классический путь активации системы комплемента, в результате чего образуется мембраноатакующий комплекс (МАК), наносящий клеточной стенке бактерии повреждения. Кроме того антитела нейтрализуют бактериальные токсины и, связываясь с инкапсулированными бактериями, облегчают их фагоцитоз макрофагами. Этот феномен называется опсонизацией. Доказано, что неопсонизированным инкапсулированным бактериям часто удается избежать фагоцитоза.

Внешне же иммунный ответ проявляется в развитии острой воспалительной реакции.

Иммунные реакции

Под иммунитетом понимают систему защиты организма от всего генетически чужеродного — будь то микробы, трансплантаты (пересаженные ткани и органы) или изменившиеся в антигенном отношении собственные клетки, включая раковые или отжившие свой срок нормальные.

Прежде чем нейтрализовать, уничтожить и элиминировать (вывести) из организма носителей генетической чужеродности, их необходимо обнаружить и распознать. Все клетки индивидуального организма имеют специальную маркировку (антигены тканевой совместимости), благодаря которой они воспринимаются иммунной системой как «свои». Клетки, не имеющие такой маркировки, воспринимаются как «чужие», атакуются и уничтожаются иммунной системой. Чужеродные вещества и клетки, вызывающие специфический иммунный ответ, называются антигенами. Различают экзогенные антигены (белки, полисахариды, искусственные полимеры, вирусы, бактерии и их токсины, трансплантаты) и эндогенные антигены , к которым относятся собственные ткани организма, измененные повреждением, и мутантные клетки, постоянно появляющиеся в организме человека (в сутки образуется до 106 мутантных клеток). Таким образом, иммунная система защищает многоклеточный организм от вторжения извне и от «внутренней измены» и, тем самым, обеспечивает генетическое постоянство всех соматических клеток, составляющих конкретный индивидуальный организм.

Иммунный ответ осуществляется иммунокомпетентными клетками и продуктами их жизнедеятельности — медиаторами иммунных реакций. Различают Т- и В-системы иммунитета. Т-система обеспечивает преимущественно противоопухолевую, антивирусную защиту, а также реакции отторжения трансплантата. В-система обеспечивает, главным образом, гуморальную антибактериальную защиту и нейтрализацию токсинов. Т-система иммунитета представлена популяцией тимусзависимых лимфоцитов (Т-лимфоцитов), которые имеют разную специализацию:

¨ Т-киллеры (Тк) — клетки-убийцы генетически чужеродных клеток;

¨ Т-хелперы (Тх) — клетки-помощники — стимулируют посредством хелперных медиаторов образование клона антигенчувствительных Т-киллеров и В-лимфоцитов;

¨ Т-супрессоры (Тс) — клетки, подавляющие посредством супрессорных медиаторов иммунный ответ.

Совместная деятельность Тх- и Тс-лимфоцитов определяет направленность, силу и продолжительность иммунного ответа. В начальный период нормального иммунного ответа превалирует активность Т-хелперов, в момент окончания — Т-супрессоров. Активность иммунокомпетентных клеток находится под контролем специальных генов иммунного ответа — Ir-генов. В частности, Ir-гены контролируют синтез антител и медиаторов иммунитета (хелперных и супрессорных).

В-система представлена популяцией В-лимфоцитов, которые, в ответ на антиген (антигенную стимуляцию), трансформируются в плазмоциты, — клетки, синтезирующие антитела (иммуноглобулины) (рис. 8.1). Фагоциты осуществляют фагоцитоз (рис. 8.2).

Рис. 8.1. Этапы формирования приобретённого иммунитета:

I — взаимодействие Т- и В-лимфоцитов с участием макрофага;

II — формирование клеток, хранящих информацию об антигенной структуре конкретного микроорганизма и способных вырабатывать специфические белки, связывающие микроорганизмы (антитела)

Рис. 8.2. Стадии фагоцитоза:

I — сближение фагоцита с объектом (комплексом антиген-антитело);

II — прилипание (адгезия) — способствуют опсонины;

III — захват фагоцитируемого объекта;

IV — переваривание комплекса антиген-антитело

Известны пять классов иммуноглобулинов: IgМ, IgG, IgА, IgE и IgD, которые продуцируются в строго определенной последовательности. IgM — низкоспецифичные антитела, которые вырабатываются первыми в ответ на антиген. Они образуют непрочную связь с антигеном и мобилизуют плазмоциты на продукцию высокоспецифичных антител (IgG и IgA). Смена синтеза IgM на синтез IgG и IgA происходит под влиянием лимфокинов (медиаторов), секретируемых Т-хелперами. IgG находятся в сыворотке крови и называются сывороточными антителами . Они прочно связывают антиген и являются самыми распространенными антителами против антигенной угрозы. IgA секретируются слизистыми оболочками носа, дыхательных путей, кишечника, урогенитальной системы. Они называются секреторными антителами и выполняют роль «первой линии обороны» в местах внедрения антигена. У млекопитающих они передаются от матери к ребенку через грудное молоко. IgE (реагины) синтезируются преимущественно в лимфоидной ткани слизистых оболочек и лимфатических узлах кишечника и бронхов. Они обладают высокой гомоцитотропностью (сродством к клеткам собственного организма) и поэтому могут выступать в качестве соучастников аллергических реакций. Роль IgD пока не установлена.

Действие иммуноглобулинов на антигены проявляется в следующих вариантах:

1. Агглютинация (склеивание) и иммунный лизис — растворение бактериальных антигенов.

Иммунный ответ

Такие иммуноглобулины называются агглютининами и бактериолизинами. Реакции иммунного лизиса происходят при участии комплемента — составной части кровяной сыворотки.

2. Цитотоксическое действие антител (цитотоксинов) — лишение клеток жизнеспособности. Эта реакция также протекает при участии комплемента.

3. Нейтрализация токсинов антителами (антитоксинами).

4. Опсонизация — усиление антителами (опсонинами) фагоцитарной активности микро- и макрофагов.

5. Преципитация — осаждение антигенов антителами.

Полноценный иммунный ответ обеспечивается кооперативным взаимодействием Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и макрофагов. Включение иммунных механизмов защиты начинается с момента проникновения антигена в организм. Макрофаг (моноцит) захватывает антиген, перерабатывает и выводит его антигенные детерминанты (структуры, обусловливающие антигенную уникальность и чужеродность) на свою клеточную поверхность. Обработанный таким образом антиген в 100-1000 раз более иммуногенен, чем нативный антиген. Он включает дальнейшие иммунные механизмы. Антигенные детерминанты, представленные макрофагом, распознаются В-лимфоцитами и Тх-клетками.

При экзогенной антигенной стимуляции В-лимфоциты трансформируются в плазмоциты и начинают сразу же продуцировать низкоспецифичные IgM. Через некоторое время, под влиянием медиаторов Т-хелперов, плазмоциты переключают синтез иммуноглобулинов на высокоспецифичные к данному антигену IgG, а затем — IgA. Одновременно Тх-лимфоциты стимулируют образование клона В- лимфоцитов, в которых формируется иммунная память на данный антиген. Таким способом обеспечивается активный иммунитет .

Тх-лимфоциты стимулируют положительный хемотаксис нейтрофильных лейкоцитов (микрофагов) к месту расположения антигена, что является важным механизмом в обезвреживании бактерий.

Эндогенная антигенная стимуляция вовлекает в иммунный ответ Тк-лимфоциты. В результате кооперации макрофага, Т-хелпера и Т-киллера, последний приобретает свойства размножаться, создавая популяцию антигенчувствительных Тк-клеток, и целенаправленно уничтожать антигены. Помимо Тк-клеток цитотоксические эффекты осуществляются Нк-лимфоцитами (натуральными киллерами), которые уничтожают клеточные антигены (клетки-мишени) без предварительной кооперации (рис. 8.3).

Полноценный иммунный ответ редко осуществляется без взаимодействия его клеточного и гуморального вариантов. Так, Т-киллеры становятся антигенчувствительными, когда связываются со специфическими иммуноглобулинами, комплементарными антигенам клеток-мишений. Макрофаги, опсонизированные иммуноглобулинами, приобретают способность направленно атаковать клетки- мишени и растворять их.

Указанные механизмы иммунного ответа лежат также в основе аллергических реакций.

Предыдущая16171819202122232425262728293031Следующая

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

Иммунные клетки и иммуноглобулины

Вместе с тем иммунная реакция может происходить по разным сценариям. Вначале иммунная система блокирует деятельность чужеродных объектов (иммуногенов), создавая особые химически реактивные молекулы (иммуноглобулины), ингибирующие деятельность иммуногенов.

Иммуноглобулины создаются лимфоцитами, которые являются основными клетками иммунной системы. Существует два основных вида лимфоцитов, при совместной активности создающих все виды иммунных реакций: T-лимфоциты (T-клетки) и B-лимфоциты (B-клетки). T-лимфоциты при восприятии чужеродного материала сами осуществляют иммунный ответ – уничтожают генетически чужеродные клетки. T-лимфоциты – это основа клеточного иммунитета.

Гуморальный иммунитет

B-лимфоциты нейтрализуют чужеродные объекты дистанционно, создавая особые химически реактивные молекулы – антитела. B-лимфоциты – это основа гуморального иммунитета.

Существует пять классов антител: IgM, IgD, IgE, IgG, IgA. Основным классом иммуноглобулинов ялвятеся IgG.

Что такое иммунная реакция или иммунный ответ?

Антитела IgG составляют около 70% от всех антител. Иммуноглобулины IgA составляют около 20% всех антител. Антитела остальных классов составляют всего 10% от всех антител.

Когда происходит гуморальная иммунная реакция, уничтожение чужеродного материала происходит в плазме крови в виде химической реакции. Иммуноглобулины, созданные вследствие иммунной реакции, могут оставаться на многие годы и десятилетия, обеспечивая организм защитой от повторного заражения, например свинкой, ветрянкой, краснухой. Благодаря этому процессу возможна вакцинация.

T-клетки отвечают за иммунный ответ на двух уровнях. На первом уровне они способствуют обнаружению чужеродного материала (иммуногена) и активируют B-клетки к синтезу иммуноглобулинов. На втором уровне, после стимуляции B-клеток к выработке иммуноглобулинов, T-клетки начинают расщеплять и разрушать чужеродный материал напрямую.

Такая активированная T-клетка уничтожает вредоносную клетку, сталкиваясь и прикрепляясь к ней вплотную – поэтому их стали называть клетками-убийцами или T-киллерами.

Клеточный иммунитет

Клеточная иммунная защита была открыта И.И. Мечниковым в конце XIX века. Он доказал, что защита организма от заражения микроорганизмами происходит благодаря способности особых клеток крови прикрепляться и расщеплять вредоносные микроорганизмы.

Этот процесс назвали фагоцитозом, а клеток-убийц, выслеживающих чужеродные микроорганизмы – фагоцитами. Синтез иммуноглобулинов и процесс фагоцитоза являются специфическими факторами иммунитета человека.

Неспецифический иммунитет

Помимо специфических, имеются неспецифические факторы иммунитета. Среди них:
непропускание возбудителей инфекции эпителием;
присутствие в кожных выделениях и желудочном соке веществ, негативно воздействующих на инфекционные агенты;
наличие в плазме крови, слюне, слезах и т.д. особых энзимных систем, расщепляющих бактерий и вирусов (например, мурамидаза).

Защита организма осуществляется не только разрушением внедряющегося в него генетически чужеродного материала, но и выведением из органов и тканей уже локализовавшихся в них иммуногенов. Известно, что вирусы, бактерии и отходы их жизнедеятельности, а также погибшие бактерии транспортируются наружу через потовые железы, мочевыделительную систему и кишечник.

Еще одним неспецифическим механизмом защиты служит интерферон – антивирусная белковая структура, синтезируемая инфицированной клеткой. Перемещаясь по внеклеточному матриксу и попадая в здоровые клетки, этот белок защищает клетку от вируса и от системы комплемента – комплекса белков, постоянно присутствующих в плазме крови и других жидкостях организма, которые уничтожают клетки, содержащие чужеродный материал.

Защита организма ослабевает чаще всего из-за несоблюдения здорового образа жизни или вследствие злоупотребления антибиотиками.

Перед применением необходимо проконсультироваться со специалистом.

Взаимодействие in vitro между специфическими антигенами и антителами называют иммунологической реакцией, которая состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab -фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

В микробиологии и иммунологии применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия специфических антигенов с антител и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Иммунологические реакции характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Серологический метод.

От латинского serum ¾ сыворотка: серология ¾ раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия АГ и AT сыворотки крови. Соответственно реакции АГ+АТ, происходящие in vitro, называются серологическими реакциями. Серология имеет огромное прикладное и практическое значение в современной клинической лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний.

Серологический метод исследования (диагностики) ¾ это метод, основанный на изучении сыворотки больного с целью определения в ней антител. В настоящее время понятие серологического метода расширено, так как разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение AT не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях: слюне, ликворе, биосекретах).

Основные характеристики:

1) взаимодействие АГ и AT строго специфично;

2) серологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и AT;

3) серологическая реакция имеет двухфазный характер:

· специфическое взаимодействие ¾ фаза невидимая;

· образование видимых комплексов ¾– для этого добавляют физиологический раствор;

4) серологическая реакция проходит по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

5) выделяется небольшое количество тепла.

Цели применения серологических реакций:

1) серологическая идентификация - это определение вида неизвестного АГ при помощи известных AT (иммунной диагностической сыворотки). В этом случае:

а) неизвестные АГ ¾ это микроорганизмы патогенные и непатогенные, токсины разного происхождения, белки крови, клетки разных органов и ткани другого вида или группы, клетки трансплантанта;

б) известные AT ¾ это стандартные препараты ¾ иммунные диагностические сыворотки (ИДС) специфичные определённому (искомому) АГ

2) серологическая диагностика (метод) ¾ это определение неизвестных AT в сыворотке крови или других биологических жидкостях больного с помощью известного АГ (диагностикума).

а) неизвестные AT ¾ это искомые AT сыворотки крови людей ¾ больных, переболевших, носителей, вакцинированных;

б) диагностикумы ¾ это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их АГ. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивацию проводят: нагреванием, формалином, спиртом и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет антигенные свойства).

Основные понятия серологии Диагностикум ¾взвесь убитых микробов. Титр антител ¾наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором произошла положительная реакция (агглютинации, связывания комплемента и т.п.). Диагностический титр ¾наименьший титр специфических антител у больного данной инфекцией человека, с которого реакция может считаться специфической (положительной). Парные сыворотки ¾двесыворотки одного пациента, первая из которых берется на 5-8 день заболевания, вторая ¾ через 10-14 дней, с целью оценить динамику иммунного ответа. Феномен нарастания титра антител ¾увеличение концентрации специфических антител в исследуемых парных сыворотках в 4 и более раз, свидетельствующее о наличие данного заболевания у человека в данный момент.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) (лат. agglutinatio ¾ склеивание) реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных (нерастворимых) антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: определения антител в сыворотке крови больных (например, при бруцеллезе ¾ реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекциях), идентификации возбудителя, выделенного от больного;

Для определения у больного антител ставятразвернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум и через 2 часа инкубации при 37 °С и 18-20 часов при комнатной температуре отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и Н-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении с физиологическим раствором 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без комков.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации , основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig) in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

2.7 Серологические реакции: цели постановки, общая классификация.

Цели постановки :

а) для идентификации антигена:

в патологическом материале (экспресс-диагностика);

в чистой культуре:

серологическая идентификация (определение вида);

серотипирование (определение серовара);

б) для выявления антител (Ig):

наличия (качественные реакции);

количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

Общая классификация серологических реакций:

а) простые (2-х компонентные: Ag + Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag + Ig + C);

в) с использованием метки.

2.8 Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

а) с корпускулярным антигеном:

пластинчатая;

объемная;

непрамая:

латекс-агглютинация;

ко-агглютинация;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) = пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция преципитации:

а) с растворимым антигеном:

объемная (например, реакция кольцепреципитации);

в геле (иммунодиффузия):

простая (по Манчини);

двойная или встречная (по Оухтерлони);

реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) (например реакция флокулляции);

другие варианты:

1. иммуноэлектрофорез;

   иммуноблотинг.

Сложные серологические реакции (3–х компонентные: Aг+Ig+C):

а) видимые:

иммобилизация;

иммунного прилипания;

лизиса (в том числе гемолиза);

б) невидимые:

реакция связывания комплемента (РСК).

2.10 Реакции с использованием метки:

РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

ИФА – иммуноферментный анализ;

РИА – радиоиммунный анализ;

ИЭМ – иммунная электронная микроскопия.

Иммунный ответ. КИО. ГИО

4 Клеточный иммунный ответ

Иммунный ответ (ИО)– это комплекснаястадийная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию .

По механизмам эффекторного действия различают ИО:

– гуморальный (обеспечивается В- системой иммунитета),

– клеточный (обеспечивается Т-системой иммунитета).

В отличие от В-системы иммунитета , которая нейтрализует антиген с помощью антител,

–Т-система иммунитета уничтожает антигены, представленные на клетках, через прямое взаимодействие субпопуляции T-клеток – специфических цитотоксических T-клеток (=CD8 T-клеток = T-киллеров) с измененными собственными или чужеродными клетками;

–Т-клетки распознают не собственно антигенный пептид (эпитоп) , а его комплекс с молекулами МНС I или МНС II .

Реакции КИО лежат в основе:

реакции отторжения трансплантанта,

аллергической реакции замедленного типа,

противоопухолевого иммунитета,

Этапы КИО:

поглощение и процессинг АГ

В качестве антигенпрезентирующих (АПК) клеток в КИО участвуют дендритные клетки или макрофаги.

Процессинг сводится к:

– расщеплению исходной молекулы до уровня специфических пептидов,

– активации синтеза в АПК антигенов МНС I или II классов,

– образованию комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса и к экспрессии его на мембране АПК.

презентация АГ:

– комплекс антигенный пептид + МНС I презентируется для опознания прецитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом CD8+;

комплекс антигенный пептид + МНС II - Т-хелперам, имеющим фенотип CD4+.

– узнавание Т-клеточным рецептором (TCR) комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса. При этом важную роль играют адгезивные молекулы CD28 на Т-лимфоцитах и CD80 (CD86) – на АПК, выполняющие функцию корецепторов;

активация Т-лимфоцитов – переход из стадии покоя в стадию G 1 клеточного цикла. Условие активации – передача сигнала от клеточной мембраны к ядру. В результате образуется ряд транскрипционных молекул, активирующих гены важнейших цитокинов. Синтезируются ИЛ2 и рецептора для него – ИЛ2R, гамма-интерферон (γИФН) и ИЛ4.

Пролиферация – размножение специфического по отношению к данному антигену клона Т-лимфоцитов (клональная экспансия ) под действие ИЛ2. Лишь размножившийся клон лимфоцитов способен выполнять функции по элиминации антигена.

Дифференцировка – процесс специализации функций клеток внутри специфического клона:

– под действием γИФН активируется процесс синтеза антигенпрезентирующими клетками ИЛ12, который воздействует на исходные специфические Т-хелперы нулевые (Th0) и тем самым способствует их дифференцировке в Тh1.

– Th1 продуцируют γИФН, ИЛ2 и факторы некроза опухоли альфа- и бета- , а также контролируют развитие клеточного иммунного ответа, и гиперчувствительности замедленного типа.

эффекторная фаза – уничтожение клетки-мишени. Происходит активация киллерной функции прецитотоксических лимфоцитов (специфических киллеров), натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов. ПреЦТЛ дифференцируются в ЦТЛ, экспрессируя рецепторы к ИЛ2.

ЦТЛ убивают внутриклеточные бактерии и простейшие, инфицированные вирусами клетки, а также клетки опухоли и аллогенного трансплантата.

Каждый ЦТЛ способен лизировать несколько чужеродных клеток-мишеней.

Этот процесс осуществляется в три стадии:

распознавание и контакт с клетками-мишенями;

летальный удар – перфорины и цитолизины действуют на мембрану клетки-мишени и образуют в ней поры;

лизис клетки-мишени – через образовавшиеся под влиянием перфоринов и цитолизинов поры проникает вода, разрывающая клетки.

Схема клеточного иммунного ответа

Закономерности развития гуморального иммунного ответа на проникновение тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов.

Протекание процесса презентации АГ лимфоциту зависит от типа антигена. Все АГ делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые. Большинство антигенов тимусзависимые. Презентация тимуснезависимого антигена проходит по схеме: М––>Вл. Презентация тимусзависимого антигена проходит по схеме: М––>Тх2––> Вл.

Тимуснезависимый антигенов мало. Они являются сильными митогенами. Должны быть полимеризованного характера и иметь большое количество одинаковых эпитопов (например: липополисахариды клеточной Гр(-) микроорганизмов). На поверхности В-лимфоцитов очень большое число антигенраспознающих рецепторов одной специфичности. Эти рецепторы подвижные. Как только на них действует липополисахарид, происходит агрегация рецепторов, приводящая к концентрированию их в одном месте в виде «шапочки» – это первый сигнал к активации В-лимфоцитов. Второй сигнал В-лимфоциты получают от макрофага в виде медиатора, которым является ИЛ1. После этого происходит активация В-лимфоцита и трансформация его в бластные клетки; они увеличиваются в размере, 6-7 раз делятся и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулин малой специфичности IgМ.

Тимуснезависимый антиген индуцирует пролиферацию клона клеток с АГ-специфическими рецепторами. Особенностью ИО в данном случае заключается в следующем: 1) не происходит переключения синтеза IgМ на синтез иммуноглобулинов класса G и др. классов; 2) тормозится ИО, т.к. не образуются клетки памяти; 3) быстро возникает иммунологическая толерантность.

Тимусзависимые антигены вызывают ИО, включающий следующие стадии: 1) Презентация антигена Т-хелперу; 2) специфическое распознание Т-хелпером антигена на поверхности макрофага через антигенраспознающий рецептор. Распознание идет в комплексе с молекулами HLA–DR. На этом этапе, получив антигенную информацию от макрофага, Т-хелпер получает медиаторный сигнал от макрофага в виде ИЛ-1. Это активирует Т-хелпер. Активированный Т-хелпер выделяет различные лимфокины (ИЛ-2,ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, митогенный и бластогенный фактор), что способствует экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов для ИЛ-2 и ИЛ-4. Это продукты самого Т-хелпера, которые поддерживают его в активном состоянии. Кроме этого, эти продукты активируют В-лимфоциты вместе с ИЛ-1, который В-лимфоцит получает от макрофага.

Иммунологические реакции используются для выявления специфических антител, идентификации возбудителей и других антигенов, определения групп крови и подбора адекватного донора при пересадках органов и тканей.

Серологические реакции - реакции между антигенами и антителами in vitro - применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена соответственно. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые - преципитации. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Антигены, по которым отдельные индивидуумы или группы особей одного вида различаются между собой, являются изоантигенами. Изоантигены, генетически связанные, объединены в группы, получившие названия: система АВО, резус и др.

В плазме человека всегда содержатся естественные, полные, холодовые изоантитела к агглютиногенам А и В. Агглютинин анти-А - a-агглютинин, а агглютинин анти-В - b -агглютинин.

Определение группы крови (определение агглютиногенов).
Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток определяют групповые агглютиногены в эритроцитах. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива, имеющих по 3 гнезда, или в 1 штатив с двумя рядами гнезд. Слева направо ставят сыворотки групп 0 α-b (I), А b (II), В α (III). Отдельно ставят сыворотку АВ0 (IV). Определение производят на белых пластинах или тарелках. На левой стороне делают надписи 0 α-b , в середине - А b , справа - В α. Под соответствующей надписью наносят по 0,1 мл каждой стандартной сыворотки отдельной для каждой сыворотки пипеткой. Кровь для исследования берут из пальца, 0,01 мл крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Перемешивают капли стандартной сыворотки с исследуемой кровью. После этого пластину покачивают, затем на 1-2 мин оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее 5 мин, несмотря на то что агглютинация начинается в течение первых 10-30 сек., так как возможна поздняя агглютинация, например эритроцитами группы А2 (II).
По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки в течение 5 мин, после чего оценивают результат. При положительной реакции в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки (агглютинанты), состоящие из склеенных эритроцитов. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается. В случае отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения (5 мин) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет, и в ней не обнаруживаются агглютинаты. Результаты реакции в каплях с сыворотками одной группы обеих серий должны быть одинаковыми. Возможны различные комбинации реакций:

1) сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию - испытуемая кровь принадлежит к группе 0 (I);

2) сыворотки групп 0 α-b (I) и В α (III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А b (II) - отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе А (II);

3) сыворотки группы 0 α-b (I) и А Я (II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В α (III) - отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе В (III);

4) сыворотки всех групп дали положительную реакцию.
В этом случае для исключения неспецифической агглютинации проводят дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0 (IV).

Отсутствие агглютинации в капле этой сыворотки при наличии ее во всех остальных позволяет отнести кровь к группе АВ0 (IV). Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0 (IV) говорит о неспецифической агглютинации. В этих случаях нужно исследование повторить с отмытыми эритроцитами.

Определение полной групповой формулы крови (агглютиногенов и агглютининов). Одновременное определение групповых антигенов эритроцитов и агглютиногенов сыворотки позволяет установить полную групповую формулу исследуемой крови. Для этого берут 2 различные серии стандартных сывороток групп крови 0 α-b (I), А b (II), В α (III), АВ0 (IV); 0,85%-ный раствор хлорида натрия; стандартные эритроциты групп 0 (I), А (II), В (III). В центрифужную пробирку, содержащую 0,25-0,5 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, добавляют 2-4 мл крови специально отобранных доноров, затем пробирку на 3/4 заполняют изотоническим раствором хлорида натрия.
Перемешивают, центрифугируют и оставляют стоять до оседания эритроцитов. Отмытые стандартные эритроциты хранят в холодильнике. Срок годности - 2-3 дня. Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива. Отдельно ставят сыворотку группы АВ0 (IV). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в отдельный штатив с тремя гнездами в порядке: группа 0 (I), А (II) и В (III). На пластинке делают надписи слева направо: 0 α-b , А b и В α для стандартных сывороток и 0, А и В - для стандартных эритроцитов. Под соответствующими обозначениями наносят по 1 большой капле всех стандартных сывороток и по 1 маленькой капле стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь для отделения сыворотки центрифугируют или оставляют стоять 20-30 мин. Исследуемую сыворотку по 1 большой капле капают на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна эритроциты исследуемой крови и наносят их по 1 маленькой капле рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухими стеклянными палочками. Через 1 мин в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 мин.

Возможные варианты реакций:

1) реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови к группе 0 (I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0 (I) и положительную - с эритроцитами групп А (II) и В (III);

2) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена А. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0 (I) и А (II), но положительную - с эритроцитами группы В (III);

3) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0 (I) и В (III), но положительную - с эритроцитами группы А (II);

4) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, т.е. не содержит агглютининов.

Определение резус-фактора методом конглютинации с применением желатина. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела-резус, в коллоидной среде - растворе желатина. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание - конглютинация, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь изотонического раствора хлорида натрия. Резус-отрицательные эритроциты не склеиваются.

Для реакции используют: стандартные сыворотки антирезус с неполными антителами двух различных серий (группа стандартной сыворотки должна быть совместима с группой исследуемой крови), 10%-ный раствор желатина в ампулах заводского изготовления, 0,85%-ный раствор хлорида натрия, 3,8%-ный раствор цитрата натрия, стандартные эритроциты для контроля.

В одну пробирку вносят 0,05 мл исследуемых эритроцитов. В другую пробирку помещают 0,05 мл стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0 (I) или группы, одноименной с исследуемой кровью. В третью пробирку - по 0,05 мл стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл 10%-ного раствора желатина, предварительно подогретого до 48 °С. Слегка встряхивают для перемешивания. После этого в первую пробирку вводят 0,1 мл сыворотки антирезус одной серии, во вторую - по 0,1 мл сыворотки антирезус второй серии. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и все пробирки помещают в водяную баню при 48 °С на 5 мин или термостат при той же температуре на 30 мин. После прогревания приливают по 8-10 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия, содержимое пробирок перемешивают и затем просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Когда кровь резус-положительна, в пробирке наблюдаются легко различимые красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне. Если эритроциты резус-отрицательны, в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки-антирезус. В контрольных образцах стандартные резус-положительные эритроциты одноименной группы или группы 0 (I) с сывороткой-антирезус должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы - отрицательный. Кроме того, отрицательный результат должен быть также во всех пробирках третьего ряда, т.е. без сыворотки-антирезус.

Определение неполных антител

Как к изоантителам, так и к аутоантителам могут относиться тепловые антитела (оптимум действия при 37 °С), главным образом, класса IgG. Они называются неполными, унивалентными и, покрывая поверхность эритроцитов, не вызывают их агглютинацию в солевом растворе, однако могут склеивать эритроциты в среде с высокой концетрацией белка (альбумина или сыворотки). Тепловые антитела класса IgG редко обладают способностью фиксировать комплемент, вызывая лизис эритроцитов, т.е. выступать в качестве гемолизинов. Обычно эритроциты, покрытые антителами IgG, секвестрируются селезенкой, где они теряют часть оболочки, что приводит к фрагментации и сфероцитозу, или агглютинируют (в среде с высокой концентрацией белка) и захватываются макрофагами. Фиксированные на эритроцитах неполные антитела выявляются прямой пробой Кумбса (антиглобулиновой пробой). Суть метода состоит в агглютинации эритроцитов, покрытых антителами класса IgG, антисывороткой кролика против γ-глобулина человека. Непрямая проба Кумбса определяет неполные антитела, содержащиеся в сыворотке крови и могущие быть как аутоантителами, так и изоантителами. В этой пробе эритроциты донора инкубируют с исследуемой сывороткой крови, затем отмывают и соединяют с антиглобулиновой сывороткой, т.е. проводят пробу Кумбса, и с ее помощью устанавливают, имеются ли на поверхности донорских эритроцитов неполные антитела. При положительном варианте происходит агглютинация эритроцитов.

Определение ристомицин-агрегации (агглютинации) в богатой тромбоцитами исследуемой плазме отражает взаимодействие фактора Виллебранда (ФВ) с собственными тромбоцитами пациента. При исследовании in vitro ристомицин способствует связыванию ФВ с тромбоцитарным рецептором ГП1в. Процесс агрегации, индуцируемый добавлением к богатой тромбоцитами исследуемой плазме стандартного количества ристомицина, регистрируется фотометрически по падению ее оптической плотности. Измерения проводятся в агрегометре или на модифицированном фотоэлектроколориметре, снабженном перемешивающим и записывающим устройствами. Ристомицин-агрегация тромбоцитов может снижаться как при качественных, так и при количественных дефектах ФВ.

Определение активности фактора Виллебранда (ристомицин-кофакторной активности - РКА) исследуемой плазмы основано на его способности вызывать в присутствии ристомицина агглютинацию нормальных донорских тромбоцитов. В классическом методе, предложенном H.I. Weiss, предлагается использование суспензии свежеприготовленных отмытых донорских тромбоцитов для измерений, проводимых в агрегометре. При этом взвесь отмытых и ресуспендированных донорских тромбоцитов должна иметь концентрацию около 250 ґ 109 /л. В кювету агрегометра добавляют взвесь доведенной исследуемой бедной тромбоцитами плазмы и стандартизованное количество ристомицина. Последующий агрегационный процесс регистрируется в течение нескольких минут с помощью записи увеличения трансмиссии. Угол наклона полученной кривой пропорционален РКА исследуемого образца плазмы. РКА исследуемой плазмы определяется в процентах по калибровочной кривой зависимости максимального изменения трансмиссии за минуту от уровня РКА. Для ее построения используется серия разведений стандартной коммерческой или пулированной плазмы, в которых РКА соответствует 100%-, 50%-, 25%-ному уровню.

В модификациях данного метода предусмотрено использование не свежих, а фиксированных формалином донорских тромбоцитов. Такая обработка тромбоцитов способствует длительному хранению их без потери рецепторов к ФВ. Для этого из донорской крови, взятой на ЭДТА-формалиновом растворе (соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в соотношении 9: 1, готовится бедная тромбоцитарная плазма. Полученный после ее удаления тромбоцитарный осадок дважды отмывается ЭДТА-буферным раствором и разводится в буфере до концентрации тромбоцитов 200-250 ґ 109/л. Полученный тромбоцитарный реагент может храниться.

В настоящее время коммерчески доступны тест-наборы, основанные на регистрации агглютинации лиофилизированных фиксированных тромбоцитов как методами агрегатометрии, так и слайд-тестами. Определение РКА в слайд-тестах требует меньших затрат времени и характеризуется более высокой точностью.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
РЕАКЦИИ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ФГБОУ
ВО ТГМУ 2016Г

план

ПЛАН
1. Серологические реакции, которые используются
для серологической диагностики.
2.Серологические реакции, которые используются
для серологической идентификации.
3.Современные методы Иммунологических
исследований при инфекционных болезнях:
(Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный
анализ, генодиагностика,
полимеразная цепная реакция).
4.Серологические реакции, которые используются в
вирусологии.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

ВСЕ СЕРОЛОГИЧНЫЕ
РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ
С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ:
для выявления антител в сыворотке больного
с помощью стандартных антигеновдиагностикумов – для серологической
диагностики инфекционной болезни;
для определения неизвестных антигенов
(бактерий, грибов, вирусов) за известными
стандартными сыворотками-антителами –
для серологической идентификации
возбудителей.

классифиация

КЛАССИФИАЦИЯ
Иммунные реакции подразделяются на простые и
сложные. Для их постановки необходимы
основные два компонента: антиген и антитело.
К простым реакциям, применяемым для
диагностики, относятся реакции агглютинации,
реакции преципитации, реакции нейтрализации.
К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный
метод, радиоиммунный метод,
иммуноферментный метод,
иммунолюминесцентный метод исследования,
метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ
Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание)
внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок
корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а
также частиц с адсорбированными на них антигенами под
влиянием антител в среде с электролитом.
Реакция протекает в две фазы.
В первой фазе происходит специфическая адсорбция
антител на поверхности клетки или частицы, несущей
соответствующие антигены,
Во второй - образование агрегата (агглютината) и
выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит
только в присутствии электролита (раствор хлорида
натрия).

Агглютинат

АГГЛЮТИНАТ
Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и
крупнохлопчатый.
Мелкозернистый – это результат
взаимодействия мелких бактерий,
крупнохлопчатый – бактерий,
имеющих жгутики.

Реакция агглютинации-типы

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ-ТИПЫ
Все реакции агглютинации
подразделяются на два типа:
ориентировочные (ОРА), которые
выполняются на стекле,
развернутые (РРА) – выполняются в
пробирках с титрованием сыворотки.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И
ЧУВСТВИТЕЛЬНА.
Повысить специфичность и чувствительность
реакции можно путем разведения исследуемой
сыворотки до ее титра или половины титра.
Титром сыворотки называется то ее максимальное
разведение, в котором обнаруживается
агглютинация антигена.
Чем выше титр антител, тем достовернее
результаты реакции.
Чтобы дифференцировать причину
положительной реакции (ранее перенесенная
инфекция, вакцинация или текущее заболевание),
оценивают динамику нарастания титра
антител, которое наблюдается только при
текущей инфекции..

Основные цели

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ
Ориентировочные реакции также могут
иметь две цели:
Идентификация микробного вида (с
использованием известной иммунной
сыворотки).
Поиск антител в сыворотке крови
пациента с использованием известного
микробного диагностикума.

10. Реакция агглютинации

РЕАКЦИЯ
АГГЛЮТИНАЦИИ

11. ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРА - ориентировочной реакции агглютинации

12. Схема ориентировочной реакции агглютинации.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ
АГГЛЮТИНАЦИИ.
Этапы выполнения реакции:
На обезжиренное стекло нанести
каплю физиологического раствора.
Внести петлей исследуемую культуру
бактерий, равномерно распределить в
капле физиологического раствора
Добавить каплю специфической
агглютинирующей иммунной
сыворотки
Учесть результат реакции.
Положительной считается реакция,
когда в капле происходит
просветление жидкости и
формирование агглютината.

13. ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

++++
Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление
жидкости. Результат положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над
осадком слегка мутновата. Результат положительный
++
Слабая
агглютинация:
осадок
небольшой,
жидкость
непрозрачная.
маленький,
надосадочная
Результат слабоположительный
+
Следы
агглютинации:
осадок
непрозрачная. Сомнительный результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.
жидкость

14. модификации Реакция агглютинации: это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ
МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА.
Реакция Минкевича позволяет определить наличие
противотуляремийных антител у инфицированного
пациента.
Необходимые ингредиенты:
Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора
из пальца больного
Дистиллированная вода
Туляремийный диагностикум.

15. Этапы выполнения реакции Минкевича:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА:
На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента
Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов
Внести каплю туляремийного диагностикума
Учесть результаты.
Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна
агглютината.

16. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить
антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента,
но и определить титр антител.
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка пациента
Физиологический раствор
Бруцеллезный диагностикум

17. Принцип метода

ПРИНЦИП МЕТОДА
основан на использовании большого стекла фотопластины,
концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в
нарастающих или уменьшающихся объёмах,
дополняемой до определённого уровня физиологическим
раствором, что приравнивается к разным разведениям, и
окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей
видимости образующегося агглютината.
Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём
лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при
+37Сº.
На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от
нескольких больных.
Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината
разной активности в зависимости от разведений.

18. реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их сер

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ
ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА
:
Данная реакция основана на способности
родственных групп бактерий адсорбировать из
антисыворотки только групповые антитела при
сохранении в ней типоспецифических антител.
Полученные сыворотки называются монорецепторным,
так как содержат антитела только к одному
определенному антигену.
При наличии у разных бактерий одинаковых или
сходных групповых антигенов они могут
агглютинироваться одной и той же антисывороткой,
что затрудняет их идентификацию.

19.

Принцип метода:
Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител
методом адсорбции
специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и
специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ -
только групповые.
В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют
родственные гетерологические АГ.
Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала
агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым
паратифа А.
Диагностикум с
антигенами
брюшного тифа
(АВСД)
Исследуемая
сыворотка с
антителами
(abcd)
2 часа +37C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
abcd
ABC
D
AT
АГ
2 часа +37 C°,
18 – 20 часов
в холод-ке
ABCD
ABEF
ABCD
ABEF

20. Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ)
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И
АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ)
Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы
полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в
присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена
или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно
быстро – на протяжении 2-7 мин.
Нагруженные антителами частицы латекса широко
используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.
Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в
сыворотке больного.
Такую модификацию РАЛ используют для выявления
противогриппозных, противокраснушных,
протикоревых антител и т.д.

21. Проведение реакции латекс-аглютинации

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
ЛАТЕКС-АГЛЮТИНАЦИИ

22. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм
Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится
белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG
человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на
стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в
окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых
находится активный центр антитела.

23. Реакция коагглютинации (КОА) .

РЕАКЦИЯ
КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА) .
Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая
одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого
материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и
др.) и стафилококкового диагностикума.
Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на
тёмном фоне должна четко будет просматриваться
мелкозернистая агглютинация стафилококков.

24. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ)
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Основана на способности антител взаимодействовать с
антигеном, фиксированным на различных
эритроцитах, которые при этом агглютинируют.
Для постановки этой реакции необходимо приготовление
эритроцитарного диагностикума.
Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов:
антигенный и антительный.

25. Этапы выполнения реакции:

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ:
Необходимые ингредиенты:
Сыворотка крови
инфицированного
пациента
В лунки планшета внести физиологический
раствор в одинаковом количестве -0,25 мл
для разведения сыворотки
В первую лунку внести сыворотку крови
пациента, разведенную в 50 раз в объеме
0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой
и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и
перенести в следующую лунку
Перемешать содержимое и повторить эту
процедуру во всех лунках, предназначенных
для проведения реакции.
Приготовить контроль, для чего в одну
лунку внести 0,25 мл физиологического
раствора
Во все лунки, включая контрольную,
внести по 2 капли приготовленного
эритроцитарного диагностикума и
перемешать путем осторожного
покачивания планшета.
Физиологический раствор
Эритроцитарный
диагностикум
Реакция пассивной
гемагглютинации
выполняется в лунках
иммунологического
планшета.

26. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на
дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в
опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика».
Схема постановки и учета РПГА

27. Критерии учета результатов реакции

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
++++
Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат
положительный
+++
Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна
лунки. Результат положительный
++
Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна
лунки. Результат сомнительный
+
Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный
результат реакции
-
Отрицательная реакция: осадок занимает центральное
положение с округлыми краями.

28. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ.

.
РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
Развернутые реакции агглютинации предложены для
поиска антител в сыворотках крови инфицированных
пациентов при некоторых бактериальных инфекциях.
При этом применяются диагностикумы,
приготовленные из микроорганизмов.
Для выполнения этих реакций необходимо
предварительное титрование сыворотки.

29. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ.
Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора
1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или
1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора
1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или
1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора.
В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора.
8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль
сыворотки и контроль антигена.
В контроль сыворотки вносим только разведенную
сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только
взвесь диагностикума.

30. Учет реакции

УЧЕТ РЕАКЦИИ
Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси
диагностикума.
В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках
просветляется, на дно оседает осадок агглютината.
Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки
должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно
мутная взвесь диагностикума.
Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно
видно формирование осадка агглютината.

31. СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты
Содержимое пробирок
Физиологический
раствор
0,85
Контроль
Сыворотки
Антигена
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
в 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
--
%
хлорида натрия, мл
Сыворотка
разведении 1:50 мл
Разведения
Диагностикум,
млрд.
(1: 50)
1: 100
1-2 2к
1: 200
1: 400
1: 800
-
2к
2к
2к
-
микробных В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при
тел в 1 мл.
комнатной температуре
2к

32. Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ
АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ:
В реакции агглютинации они корпускулярные, даже
целые клетки, а в реакции преципитации –
молекулярные, в растворимом состоянии.
Антигенами могут быть экстракты
микроорганизмов, тканей, органов, химические
вещества.
Феномен преципитации заключается в том, что
антитела (преципитины), соединяясь с
растворимыми антигенами (преципитиногенами),
предопределяют образование осадка (преципитата)
или помутнения раствора.
За титр реакции принимают наибольшее разведение
антигена, которое дает положительный результат.

33. Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО
ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ПРАКТИКЕ:
В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения
видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду
принадлежит выявленная кровь.
Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для
диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы,
дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской
язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех,
щетина).
Реакцию Ухтерлони используют для определения
антигенного состава органов и тканей, как нормальных,
так и опухолевых, количества антигенов в сложных
системах.
Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других
заболеваний.

34. . Выявление АГ в реакции кольцепреципитации.

. ВЫЯВЛЕНИЕ АГ В РЕАКЦИИ
КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ.

35. Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС).
Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых
обследованиях на сифилис.
В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов,
антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический).
Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета.
Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов
применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген
(контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная
сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата).
В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении
1:10 и кардиолипиновый антиген.
После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем
планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в
лунке становится прозрачной.
Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат,
оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4
++++ - положительным. Схема реакции микропреципитации
представлена на рис. 10.

36. Экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА
СИФИЛИСА (ЭДС).

37. Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ)
Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии
антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена
образуют линии и полосы преципитации.
Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной
диффузии, можно проводить количественное определение
антигенов.
Взаимное расположение линий преципитации в тестах двойной и
встречной иммунодиффузии позволяет оценивать
иммунохимическое сходство или различие антигенных
компонентов.
Методы иммунодиффузии характеризуются высокой
специфичностью и чувствительностью.
Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации
белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови,
цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты
различных органов и т. д.

38. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Метод объединяет реакцию преципитации в геле с
электрофорезом.
Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его
разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую
канавку.
В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в
течение 1-2 часов.
Различные антигены с разной скоростью перемещаются между
катодом и анодом.
Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через
5-7 суток в геле образуются зоны преципитации.
Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями
(например, амидо черным).

39. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

40. Иммуноэлектрофорез

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ
дуги преципитации.

41. Реакция бактериолиза

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА
применяется редко, она используется для
дифференциальной диагностики холерного вибриона от
других холероподобных бактерий.
В основе реакции лежит способность специфических антител
образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе
с бактериями,
что приводит к активации системы комплемента по
классическому пути и лизису бактерий.

42. В реакции гемолиза

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА
антигеном служат эритроциты, антителом –
антигемолитические антитела.
При образовании комплекса антиген-антитело начинается
активация комплемента, в результате чего мутная взвесь
эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную
жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода
гемоглобина.
При постановке диагностической реакции связывания
комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как
индикаторная: для тестирования присутствия или
отсутствия (связывания) свободного комплемента.

43. Реакция лизиса и связывание комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ
КОМПЛЕМЕНТА.
Необходимые антиген, антитело и комплемент.
Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или
другие клетки.
Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку
или сыворотку больного.
В зависимости от того, против каких клеток направленное
действие лизины, они имеют свои названия:
против бактерий - бактериолизины, спирохет спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других
клеток - цитолизины.
Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим
путем и вызывает растворение клетки.
Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают
несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

44. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
При образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда
присоединяется комплемент.
Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то
комплемент не связывается, остается свободным в системе.
При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины
свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз
эритроцитов.
Этот принцип и положено в основу РСК.
При соответствии антигена антителу с ним связывается
комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты
барана и гемолитическую сыворотку.
При отсутствии гемолиза заключают, что реакция
положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

45. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).
Опытная система
АНТИГЕН
(Бактерия, клетка, вирус и
т.д.)
КОМПЛЕМЕНТ
АНТИТЕЛО
(сыворотка) Комплемент
связался с комплексом
антиген-антитело
Индикаторная гемолитиче
ская система
ЭРИТРОЦИТЫ
БАРАНА (АНТИГЕН)
ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ
СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)
Комплемента нет - связался
с опытной системой.
Без комплемента гемолиз
эритроцитов
невозможен.

46. Реакция связывания комплемента (РСК).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА (РСК).

47. Критерии учета результатов реакции

++++
Полная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная
РСК.
+++
Неполная
задержка
гемолиза,
эритроциты
в
осадке,
надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета;
положительная РСК.
++
Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость
красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная
РСК.
+
Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная
РСК.
-
Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная
РСК.

48. (РСК)

49. Определение антирезус - антител в сыворотке.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ.
Данная реакция проводится у беременных женщин,
имеющих отрицательный резус-фактор.
В случае, если у отца ребенка положительный резус-фактор,
то у плода возможен как положительный, так и
отрицательный резус.
Для предотвращения резус-конфликта необходимо знать,
образуются ли антирезус-антитела в течение беременности
и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их
титра.

50. Для постановки данной реакции необходимы следующие ингредиенты

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ
НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ
Исследуемая сыворотка
Эритроциты человека, несущие положительный резус-фактор
(стандартные эритроциты)
Комплемент.
Этапы постановки теста:
В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки
В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных
эритроцитов
Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе.
В качестве положительного контроля используем сыворотку,
имеющую антирезус-антитела; в качестве отрицательного
контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

51. Учет результата ведется по гемолизу:

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ:
В пробирке с отрицательным контролем
наблюдаем осадок эритроцитов
- В пробирке с положительным контролем
– полный гемолиз, то есть
равномерно окрашенная в красный цвет
жидкость
- В исследуемых образцах при наличии
антирезус-антител – полный гемолиз, при
их отсутствии – осадок эритроцитов.

52. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Реакция широко применяется в вирусологии для
определения вида (типа) возбудителя и титра
вируснейтрализующих антител.
Эти антитела обычно выявляются при
смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим введением этой
смеси восприимчивым лабораторным животным
или заражением культуры клеток.
На основании выживания животного в первом
случае или отсутствия цитопатического действия
вируса во втором судят о нейтрализующей
активности сыворотки.

53. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА)
Основана на свойстве
антисыворотки подавлять вирусную
гемагглютинацию, так как нейтрализованный
специфическими антителами вирус утрачивает
способность агглютинировать эритроциты.
РТГА широко применяется для серодиагностики
вирусных инфекций с целью обнаружения
специфических антигемагглютининов
и для идентификации многих вирусов по их
гемагглютининам (антигенам).

54. РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ

Участвуют меченые антигены или антитела.
К ним относятся реакции
иммунофлюоресценции,
радиоиммунный
иммуноферментный методы.
По своей чувствительности они превосходят
все описанные выше
серологические реакции.

55. Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу) метод экспресс-диагностики,

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО
КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ,
Для выявления микробных антигенов в
тканях использовали меченую
диагностическую сыворотку, содержащую
антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактерий,
вирусов).
Метку антител производят
флюорохромами(изотиоцианат
флюоресцеина)

56. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

включает использование коммерческих реагентов – антигенов
или антител, маркированных ферментами (например,
пероксидазой или щелочной фосфатазой).
Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках
фиксирован антиген или антитело.
После образования иммунного комплекса в систему вносят
субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к
окрашиванию среды.
В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет
непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с
антителом в специфической фазе,
а не анализировать вторичные проявления взаимодействия –
агглютинацию, преципитацию или гемолиз.
Метод отличает высокая чувствительность – обычно
достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

57. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

58. Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ
ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ):
В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген
ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена
для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо
отрицательной
Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут
Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз
Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против
иммуноглобулинов человека, меченные ферментом
Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз
Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и
бензидин
Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте
Проводим визуальный учет результатов и определение оптической
плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

59. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

При правильной постановке анализа в лунке, содержащей
положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он
становится желтым.
В отрицательном контроле цвет прозрачный.
Учет результатов опытных образцов зависит от изменения
цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в
положительном контроле, значит, у данного пациента
обнаружены антитела к ВИЧ.

60. упрощения использования ИФА «безреагентные» системы

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ
Для проведения анализа необходимо только нанести на носитель
образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя,
происходящее вследствие образования продукта ферментативной
реакции.
Преимущества:
не используются радиоактивные изотопы,
стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение
длительного времени,
измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне,
результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без
применения аппаратуры (визуально).
ИФА очень легко поддается автоматизации.

61. Радиоиммунологический анализ (РИА)

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ (РИА)
Преимущество РИА: отсутствует необходимость оценивать
протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как
агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов.
2 варианта:
меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное
число участков связывания со специфическими антителами.
Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие,
должна существовать определенная степень родства между
меченым и немеченым антигеном.
После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а
затем со стандартным меченым антигеном
количество включившегося в состав иммунных комплексов
меченого антигена будет обратно пропорционально количеству
немеченого антигена в исследуемой пробе..

62. Источники информации:

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
Основные А.
.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология,
иммунология и вирусология. -С-П.,2000.
Медицинская микробиология./ Под ред. В.И. Покровского.М.,
2001.
Л.Б.Борисов.Медицинская
микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001
Медицинская микробиология,вирусология /Под
ред. А.А.Воробьева.М.2004.