Иммунологические реакции их компоненты цели постановки. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Реакции с участием меченых антигенов или антител

Понятие иммунитет обозначает невосприимчивость организма ко всяким генетически чужеродным агентам, в том числе и болезнетворным микроорганизмам и их ядам (от лат. immunitas - освобождение от чего-либо).

При попадании в организм генетически чужеродных структур (антигенов) приходит в действие целый ряд механизмов и факторов, которые распознают и обезвреживают эти чуждые для организма субстанции.

Система органов и тканей, осуществляющая защитные реакции организма против нарушения постоянства его внутренней среды (гомеостаза), называется иммунной системой.

Наука об иммунитете - иммунология изучает реакции организма на чужеродные вещества, в том числе и микроорганизмы; реакции организма на чужеродные ткани (совместимость) и на злокачественные опухоли; определяет иммунологические группы крови и т. д. Основы иммунологии были заложены стихийными наблюдениями древних о возможности искусственного предохранения человека от заразной болезни. Наблюдения за людьми, находившимися в очаге эпидемии, привели к заключению, что заболевают не все. Так, не болеют чумой выздоровевшие от этой болезни; корью обычно болеют один раз в детстве; перенесшие коровью оспу, не болеют натуральной и т. п.

Известны способы древних народов предохранять от укуса змеи, втирая в насечки на коже растения, растертые со змеиным ядом; защищать стада от перипневмонии скота, делая также насечки на коже кинжалом, предварительно погруженном в легкие быка, погибшего от этого заболевания.

Впервые искусственную прививку с целью предупреждения инфекции произвел Э. Дженнер (1876). Однако только Л. Пастер сумел научно обосновать принципы искусственной защиты от инфекционных болезней. Он доказал, что заражение ослабленными возбудителями ведет к невосприимчивости организма при повторных встречах с этими микроорганизмами.

Пастер разработал препараты, предохраняющие от заболевания сибирской язвой и бешенством.

Дальнейшее развитие иммунология получила в работах И. И. Мечникова о значении клеточного иммунитета (фагоцитоза) и П. Эрлиха о роли гуморальных факторов (жидкостей организма) для развития невосприимчивости.

В настоящее время иммунология - это наука, в которой защита от инфекционных болезней является лишь одним из звеньев. Она объясняет причины совместимости и отторжения тканей при пересадке органов, гибель плода при резус-конфликтной ситуации, осложнения при переливании крови, решает задачи судебной медицины и т. п.

Основные виды иммунитета представлены на схеме.

Наследственный (видовой) иммунитет

Наследственный (видовой) иммунитет - это наиболее прочная и совершенная форма невосприимчивости, которая обусловлена передающимися по наследству факторами резистентности (устойчивости).

Известно, что человек невосприимчив к чуме собак и рогатого скота, а животные не болеют холерой и дифтерией. Однако наследственный иммунитет не абсолютен: создавая особые, неблагоприятные условия для макроорганизма, можно изменить его невосприимчивость. Например, перегрев, охлаждение, авитаминоз, действие гормонов приводят к развитию заболевания, которое обычно человеку или животному несвойственно. Так, Пастер, охлаждая кур, вызывал у них при искусственном заражении заболевание сибирской язвой, которой они в обычных условиях не болеют.

Приобретенный иммунитет

Приобретенный иммунитет у человека формируется в течение жизни, по наследству он не передается.

Естественный иммунитет . Активный иммунитет формируется после перенесенного заболевания (его называют постинфекционным). В большинстве случаев он длительно сохраняется: после кори, ветряной оспы, чумы и др. Однако после некоторых заболеваний длительность иммунитета невелика и не превышает одного года (грипп, дизентерия и др.). Иногда естественный активный иммунитет развивается без видимого заболевания. Он формируется в результате скрытой (латентной) инфекции или многократного инфицирования небольшими дозами возбудителя, не вызывающими явно выраженного заболевания (дробная, бытовая иммунизация).

Пассивный иммунитет - это иммунитет новорожденных (плацентарный), приобретенный ими через плаценту в период внутриутробного развития. Новорожденные могут также получить иммунитет с молоком матери. Этот вид иммунитета непродолжителен и к 6-8 мес, как правило, исчезает. Однако значение естественного пассивного иммунитета велико - он обеспечивает невосприимчивость грудных детей к инфекционным заболеваниям.

Искусственный иммунитет . Активный иммунитет человек приобретает в результате иммунизации (прививок). Этот вид иммунитета развивается после введения в организм бактерий, их ядов, вирусов, ослабленных или убитых разными способами (прививки против коклюша, дифтерии, оспы).

При этом в организме происходит активная перестройка, направленная на образование веществ, губительно действующих на возбудителя и его токсины (антитела). Происходит также изменение свойств клеток, уничтожающих микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Развитие активного иммунитета происходит постепенно в течение 3-4 нед и сохраняется он сравнительно длительное время - от 1 года до 3-5 лет.

Пассивный иммунитет создают введением в организм готовых антител. Этот вид иммунитета возникает сразу после введения антител (сывороток и иммуноглобулинов), но сохраняется всего 15-20 дней, после чего антитела разрушаются и выводятся из организма.

Понятие "местный иммунитет" было введено А. М. Безредкой. Он считал, что отдельные клетки и ткани организма обладают определенной восприимчивостью. Иммунизируя их, создают как бы барьер для проникновения возбудителей инфекции. В настоящее время доказано единство местного и общего иммунитета. Но значение невосприимчивости отдельных тканей и органов к микроорганизмам несомненно.

Помимо указанного выше разделения иммунитета по происхождению, различают формы иммунитета, направленные на разные антигены.

Антимикробный иммунитет развивается при заболеваниях, обусловленных различными микроорганизмами или при введении корпускулярных вакцин (из живых ослабленных или убитых микроорганизмов).

Антитоксический иммунитет вырабатывается по отношению к бактериальным ядам - токсинам.

Антивирусный иммунитет формируется после вирусных заболеваний. Этот вид иммунитета большей частью длительный и стойкий (корь, ветряная оспа и др.). Антивирусный иммунитет развивается также при иммунизации вирусными вакцинами.

Кроме того, иммунитет можно разделить в зависимости от периода освобождения организма от возбудителя.

Стерильный иммунитет . Большинство возбудителей исчезает из организма при выздоровлении человека. Этот вид иммунитета называют стерильным (корь, оспа и др.).

Нестерильный иммунитет . Восприимчивость к возбудителю инфекции сохраняется только в период пребывания его в организме хозяина. Такой иммунитет называют нестерильным или инфекционным. Этот вид иммунитета наблюдают при туберкулезе, сифилисе и некоторых других инфекциях.

Контрольные вопросы

1. Что такое иммунитет?

2. Какие Вы знаете формы иммунитета?

Невосприимчивость человека к инфекционным заболеваниям обусловлена совместным действием неспецифических и специфических факторов защиты.

Неспецифическими называют врожденные свойства организма, которые способствуют уничтожению самых различных микроорганизмов на поверхности тела человека и в полостях его организма.

Развитие специфических факторов защиты происходит после соприкосновения организма с возбудителями или токсинами; действие этих факторов направлено только против этих возбудителей или их токсинов.

Неспецифические факторы защиты организма

Существуют механические, химические и биологические факторы, предохраняющие организм от вредных воздействий различных микроорганизмов.

Кожа . Неповрежденная кожа является барьером для проникновения микроорганизмов. При этом имеют значение механические факторы: отторжение эпителия и выделения сальных и потовых желез, которые способствуют удалению микроорганизмов с кожи.

Роль химических факторов защиты также выполняют выделения желез кожи (сальных и потовых). Они содержат жирные и молочные кислоты, обладающие бактерицидным (убивающим бактерии) действием.

Биологические факторы защиты обусловлены губительным воздействием нормальной микрофлоры кожи на патогенные микроорганизмы.

Слизистые оболочки разных органов являются одним из барьеров на пути проникновения микроорганизмов. В дыхательных путях механическая защита осуществляется с помощью мерцательного эпителия. Движение ресничек эпителия верхних дыхательных путей постоянно передвигает пленку слизи вместе с различными микроорганизмами по направлению к естественным отверстиям: ротовой полости и носовым ходам. Такое же воздействие на бактерий оказывают волоски носовых ходов. Кашель и чиханье способствуют удалению микроорганизмов, предотвращают их аспирацию (вдыхание).

В слезах, слюне, материнском молоке и других жидкостях организма содержится лизоцим. Он оказывает губительное (химическое) действие на микроорганизмы. Также влияет на микроорганизмы кислая среда желудочного содержимого.

Нормальная микрофлора слизистых оболочек, как фактор биологической защиты, является антагонистом патогенных микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1. Что такое неспецифические факторы защиты?

2. Какие факторы препятствуют проникновению патогенных микроорганизмов через кожу и слизистые оболочки?

Воспаление - реакция макроорганизма на чужеродные частицы, проникающие в его внутреннюю среду. Одной из причин воспаления является внедрение в организм возбудителей инфекции. Развитие воспаления приводит к уничтожению микроорганизмов или освобождению от них.

Воспаление характеризуется нарушением циркуляции крови и лимфы в очаге поражения. Оно сопровождается повышением температуры, отеком, краснотой и болевыми ощущениями.

Клеточные факторы неспецифической защиты

Фагоцитоз

Одним из основных механизмов воспаления является фагоцитоз - процесс поглощения бактерий.

Явление фагоцитоза впервые описано И. И. Мечниковым. Он начал изучение фагоцитоза от одноклеточной амебы, для которой фагоцитоз является способом усвоения пищи. Проследив этот процесс на разных ступенях развития животного мира, И. И. Мечников завершил его открытием специализированных клеток человека, с помощью которых происходит уничтожение бактерий, рассасывание мертвых клеток, очагов кровоизлияний и т. д. Так было создано учение о фагоцитозе, которое и сегодня имеет огромное значение.

Фагоцитарной активностью обладают различные клетки организма (лейкоциты крови, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов). Наиболее выражена эта активность у подвижных полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов крови и тканевых макрофагов, в меньшей степени - у клеток костного мозга. Все одноядерные фагоцитирующие клетки (и их костномозговые предшественники) объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ).

Фагоцитирующие клетки имеют лизосомы, в которых находится более 25 различных гидролитических ферментов и белков, обладающих антибактериальными свойствами.

Стадии фагоцитоза . Этап 1 - приближение фагоцита к объекту за счет химического влияния последнего. Это движение называют положительным хемотаксисом (в сторону объекта).

Этап 2 - прилипание микроорганизмов к фагоцитам.

Этап 3 - поглощение микроорганизмов клеткой, образование фагосомы.

Этап 4 - образование фаголизосомы, куда поступают ферменты и бактерицидные белки, гибель и переваривание возбудителя.

Процесс, который заканчивается гибелью фагоцитированных микробов, называется завершенным фагоцитозом.

Однако некоторые микроорганизмы, находясь внутри фагоцитов, не погибают, а иногда даже размножаются в них. Это - гонококки, микобактерии туберкулеза, бруцеллы. Такое явление называют незавершенным фагоцитозом; при этом погибают фагоциты.

Как и другие физиологические функции, фагоцитоз зависит от состояния организма - регулирующей роли центральной нервной системы, питания, возраста.

Фагоцитарная деятельность лейкоцитов изменяется при многих и часто неинфекционных заболеваниях. Определяя ряд показателей фагоцитоза, можно установить течение болезни - выздоровление или ухудшение состояния больного, эффективность проводимого лечения и пр.

Для оценки функционального состояния фагоцитов чаще всего определяют поглотительную активность по двум тестам: 1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих клеток (число лейкоцитов с поглощенными микробами из 100 наблюдаемых); 2) фагоцитарное число - среднее количество поглощенных одним лейкоцитом микробов или других объектов фагоцитоза.

Бактерицидные возможности фагоцитов определяют по числу лизосом, активности внутриклеточных ферментов и другими методами.

Активность фагоцитоза связана с наличием в сыворотке крови антител - опсонинов. Эти антитела усиливают фагоцитоз, готовят поверхность клетки к поглощению ее фагоцитом.

Активность фагоцитоза в значительной степени определяет невосприимчивость организма к тому или иному возбудителю. При одних заболеваниях фагоцитоз является основным фактором защиты, при других - вспомогательным. Однако во всех случаях отсутствие фагоцитарной способности клеток резко ухудшает течение и прогноз заболевания.

Клеточная реактивность

Развитие инфекционного процесса и формирование иммунитета полностью зависят от первичной чувствительности клеток к возбудителю. Наследственный видовой иммунитет - пример отсутствия чувствительности клеток одного вида животных к микроорганизмам, патогенным для других. Механизм этого явления изучен недостаточно. Известно, что реактивность клеток меняется с возрастом и под влиянием различных факторов (физических, химических, биологических).

Контрольные вопросы

1. Что такое фагоцитоз?

2. Какие стадии фагоцитоза Вы знаете?

3. Что такое завершенный и незавершенный фагоцитоз?

Гуморальные факторы неспецифической защиты

Помимо фагоцитов, в крови находятся растворимые неспецифические вещества, губительно действующие на микроорганизмы. К ним относятся комплемент, пропердин, β-лизины, х-лизины, эритрин, лейкины, плакины, лизоцим и др.

Комплемент (от лат. complementum - дополнение) представляет собой сложную систему белковых фракций крови, обладающую способностью лизировать микроорганизмы и другие чужеродные клетки, например эритроциты. Различают несколько компонентов комплемента: С 1 , С 2 , С 3 и т. д. Комплемент разрушается при температуре 55° С в течение 30 мин. Это свойство называется термолабильностью. Он разрушается также при встряхивании, под влиянием УФ-лучей и т. п. Помимо сыворотки крови, комплемент обнаружен в различных жидкостях организма и в воспалительном экссудате, но отсутствует в передней камере глаза и спинномозговой жидкости.

Пропердин (от лат. properde - подготовлять) - группа компонентов нормальной сыворотки крови, активирующая комплемент в присутствии ионов магния. Он сходен с ферментами и играет важную роль в устойчивости организма к инфекции. Снижение уровня пропердина в сыворотке крови свидетельствует о недостаточной активности иммунных процессов.

β-лизины - термостабильные (устойчивые к действию температуры) вещества сыворотки крови человека, обладающие антимикробным действием, в основном по отношению к грамположительным бактериям. Разрушаются при 63° С и под действием УФ-лучей.

Х-лизин - термостабильное вещество, выделенное из крови больных с высокой температурой. Обладает способностью без участия комплемента лизировать бактерии, главным образом грамотрицательные. Выдерживает нагревание до 70-100° С.

Эритрин выделен из эритроцитов животных. Оказывает бактериостатическое действие на возбудителей дифтерии и некоторые другие микроорганизмы.

Лейкины - бактерицидные вещества, выделенные из лейкоцитов. Термостабильны, разрушаются при 75-80° С. Обнаруживаются в крови в очень небольших количествах.

Плакины - сходные с лейкинами вещества, выделенные из тромбоцитов.

Лизоцим - фермент, разрушающий оболочку микробных клеток. Он содержится в слезах, слюне, жидкостях крови. Быстрое заживление ран конъюнктивы глаза, слизистых оболочек полости рта, носа объясняется в значительной степени наличием лизоцима.

Бактерицидными свойствами обладают также составные компоненты мочи, простатическая жидкость, экстракты различных тканей. В нормальной сыворотке содержится в небольшом количестве интерферон.

Контрольные вопросы

1. Что такое гуморальные факторы неспецифической защиты?

2. Какие гуморальные факторы неспецифической защиты Вы знаете?

Специфические факторы защиты организма (иммунитет)

Перечисленные выше компоненты не исчерпывают всего арсенала факторов гуморальной защиты. Главными среди них являются специфические антитела - иммуноглобулины, образующиеся при введении в организм чужеродных агентов - антигенов.

Антигены

Антигены - генетически чужеродные для организма вещества (белки, нуклеопротеиды, полисахариды и др.), на введение которых организм отвечает развитием специфических иммунологических реакций. Одна из таких реакций - образование антител.

Антигены обладают двумя основными свойствами: 1) иммуногенностью, т. е. способностью вызывать образование антител и иммунных лимфоцитов; 2) способностью вступать с антителами и иммунными (сенсибилизированными) лифоцитами в специфическое взаимодействие, которое проявляется в виде иммунологических реакций (нейтрализации, агглютинации, лизиса и др.). Антигены, обладающие обоими признаками, называются полноценными. К ним относятся чужеродные белки, сыворотки, клеточные элементы, токсины, бактерии, вирусы.

Вещества, не вызывающие иммунологических реакций, в частности выработку антител, но вступающие в специфическое взаимодействие с готовыми антителами, получили название гаптенов - неполноценных антигенов. Гаптены приобретают свойства полноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными веществами - белками, полисахаридами.

Условиями, определяющими антигенные свойства различных веществ, являются: чужеродность, макромолекулярность, коллоидное состояние, растворимость. Проявляется антигенность при попадании вещества во внутреннюю среду организма, где происходит встреча его с клетками иммунной системы.

Специфичность антигенов, способность их соединяться только с соответствующим антителом - уникальное биологическое явление. Оно лежит в основе механизма сохранения постоянства внутренней среды организма. Это постоянство обеспечивает иммунная система, распознающая и уничтожающая генетически чужеродные вещества (в том числе и микроорганизмы, их яды), находящиеся в его внутренней среде. Иммунная система человека несет постоянный иммунологический надзор. Она способна распознавать чужеродность при отличии клетки всего по одному гену (раковые).

Специфичность - особенность строения веществ, по которой антигены отличаются друг от друга. Она определяется антигенной детерминантой, т. е. небольшим участком молекулы антигена, который и соединяется с антителом. Число таких участков (группировок) у разных антигенов различно и определяет число молекул антител, с которыми может соединяться антиген (валентность).

Способность антигенов соединяться только с теми антителами, которые возникли в ответ на активацию иммунной системы данным антигеном (специфичность), используется в практике: 1) диагностика инфекционных болезней (определение специфических антигенов возбудителя или специфических антител в сыворотке крови больного); 2) профилактика и лечение больных инфекционными болезнями (создание невосприимчивости к определенным микробам или токсинам, специфическая нейтрализация ядов возбудителей ряда болезней при иммунотерапии).

Иммунная система четко дифференцирует "свои" и "чужие" антигены, реагируя только на последние. Однако возможны реакции на собственные антигены организма - аутоантигены и возникновение против них антител - аутоантител. Аутоантигенами становятся "забарьерные" антигены - клетки, вещества, которые в течение жизни идивидуума не контактируют с иммунной системой (хрусталик глаза, сперматозоиды, щитовидная железа и др.), а приходят в соприкосновение с ней при различных повреждениях, всасываясь обычно в кровь. А поскольку при развитии организма эти антигены не распознавались как "свои", то не сформировалась естественная толерантность (специфическая иммунологическая безответность), т. е. в организме остались клетки иммунной системы, способные к иммунному ответу на эти собственные антигены.

В результате появления аутоантител могут развиться аутоиммунные заболевания как следствие: 1) прямого цитотоксического действия аутоантител на клетки соответствующих органов (например, зоб Хасимото - повреждение щитовидной железы); 2) опосредованного действия комплексов аутоантиген - аутоантитело, которые откладываются в поражаемом органе и вызывают его повреждение (например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит).

Антигены микроорганизмов . Микробная клетка содержит большое число антигенов, имеющих разное расположение в клетке и разное значение для развития инфекционного процесса. У разных групп микроорганизмов антигены имеют различный состав. У кишечных бактерий хорошо изучены О-, К-, Н-антигены.

О-антиген связан с клеточной стенкой микробной клетки. Его обычно называли "соматическим", так как считали, что этот антиген заключен в теле (соме) клетки. О-антиген грамотрицательных бактерий - сложный липополисахаридно-протеиновый комплекс (эндотоксин). Он термостабилен, не разрушается при обработке спиртом и формалином. Состоит из основного ядра (core) и боковых полисахаридных цепей. Специфичность О-антигенов зависит от строения и состава этих цепей.

К-антигены (капсульные) связаны с капсулой и клеточной стенкой микробной клетки. Их называют также оболочечными. К-антигены расположены более поверхностно, чем О-антигены. Они являются главным образом кислыми полисахаридами. Имеется несколько видов К-антигенов: А, В, L и др. Эти антигены отличаются друг от друга по устойчивости к температурным воздействиям. А-антиген наиболее устойчив, L - наименее. К поверхностным антигенам относят и Vi-антиген, который имеется у возбудителей брюшного тифа и некоторых других кишечных бактерий. Он разрушается при 60° С. Наличие Vi-антигена связывали с вирулентностью микроорганизмов.

Н-антигены (жгутиковые) локализуются в жгутиках бактерий. Они представляют собой особый белок - флагеллин. Разрушаются при нагревании. При обработке формалином сохраняют свои свойства (см. рис. 70).

Протективный антиген (защитный) (от лат. protectio - покровительство, защита) образуется возбудителями в организме больного. Возбудители сибирской язвы, чумы, бруцеллеза способны образовывать протективный антиген. Его обнаруживают в экссудатах пораженных тканей.

Выявление антигенов в патологическом материале является одним из способов лабораторной диагностики инфекционных болезней. Для выявления антигена применяют различные иммунные реакции (см. ниже).

При развитии, росте и размножении микроорганизмов их антигены могут меняться. Происходит утрата некоторых антигенных компонентов, более поверхностно расположенных. Это явление носит название диссоциации. Примером ее может служить "S" - "R"-диссоциация.

Контрольные вопросы

1. Что такое антигены?

2. Каковы основные свойства антигенов?

3. Какие антигены микробной клетки Вы знаете?

Антитела

Антитела - это специфические белки крови - иммуноглобулины, образующиеся в ответ на введение антигена и способные специфически реагировать с ним.

В сыворотке человека имеется два вида белков: альбумины и глобулины. Антитела связаны в основном с глобулинами, измененными под воздействием антигена и названными иммуноглобулинами (Ig). Глобулины неоднородны. По скорости движения в геле при пропускании через него электрического тока их делят на три фракции: α, β, γ. Антитела принадлежат главным образом к γ-глобулинам. Эта фракция глобулинов имеет наибольшую скорость движения в электрическом поле.

Иммуноглобулины характеризуют по молекулярной массе, скорости осаждения при ультрацентрифугировании (центрифугировании с очень большой скоростью) и т. п. Различия этих свойств позволили разделить иммуноглобулины на 5 классов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Все они играют роль в развитии иммунитета против инфекционных заболеваний.

Иммуноглобулины G (IgG) составляют около 75% всех иммуноглобулинов человека. Они наиболее активны в развитии иммунитета. Единственные из иммуноглобулинов проникают через плаценту, обеспечивая пассивный иммунитет плода. Имеют небольшую молекулярную массу и скорость осаждения при ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины М (IgM) образуются в организме плода и первыми появляются после заражения или иммунизации. К этому классу принадлежат "нормальные" антитела человека, которые образуются в течение его жизни, без видимого проявления инфекции или при бытовом многократном инфицировании. Имеют большую молекулярную массу и скорость осаждения при ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины A (IgA) обладают способностью проникать в секреты слизистых (молозиво, слюна, содержимое бронхов и др.). Они играют роль в защите слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов от микроорганизмов. По величине молекулярной массы и скорости осаждения при ультрацентрифугировании близки к IgG.

Иммуноглобулины Е (IgE) или реагины несут ответственность за аллергические реакции (см. главу 13). Играют роль в развитии местного иммунитета.

Иммуноглобулины D (IgD). Обнаружены в небольшом количестве в сыворотке крови. Изучены недостаточно.

Структура иммуноглобулинов . Молекулы иммуноглобулинов всех классов построены одинаково. Наиболее простая структура у молекул IgG: две пары полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью (рис. 31). Каждая пара состоит из легкой и тяжелой цепи, различающихся по молекулярной массе. Каждая цепь имеет постоянные участки, которые предопределены генетически, и переменные, образующиеся под воздействием антигена. Это специфические участки антитела называют активными центрами. Они вступают во взаимодействие с антигеном, который вызвал образование антител. Количество активных центров в молекуле антитела определяет валентность - число молекул антигена, с которым может связаться антитело. IgG и IgA - двухвалентны, IgM - пятивалентны.

Иммуногенез - антителообразование зависит от дозы, кратности и способа введения антигена. Различают две фазы первичного иммунного ответа на антиген: индуктивную - от момента введения антигена до появления антителообразующих клеток (до 20 ч) и продуктивную, которая начинается к концу первых суток после введения антигена и характеризуется появлением антител в сыворотке крови. Количество антител постепенно увеличивается (к 4-му дню), достигая максимума на 7-10-й день и уменьшается к концу первого месяца.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении антигена. При этом индуктивная фаза значительно короче - антитела вырабатываются быстрее и интенсивнее.

Контрольные вопросы

1. Что такое антитела?

2. Какие Вы знаете классы иммуноглобулинов?

Клеточные механизмы иммунного ответа

Лимфоидные клетки организма выполняют основную функцию в развитии иммунитета - невосприимчивости, не только по отношению к микроорганизмам, но и ко всем генетически чужеродным клеткам, например при пересадке тканей. Лимфоидные клетки обладают способностью отличать "свое" от "чужого" и устранять "чужое" (элиминировать).

Родоначальницей всех клеток иммунной системы является кроветворная стволовая клетка. В дальнейшем происходит развитие двух типов лимфоцитов: Т и В (тимусзависимых и бурсазависимых). Эти названия клетки получили в связи с их происхождением. Т-клетки развиваются в тимусе (зобной, или вилочковой железе) и под влиянием веществ, выделяемых тимусом, в периферической лимфоидной ткани.

Название В-лимфоциты (бурсазависимые) произошло от слова "бурса" - сумка. В сумке Фабрициуса у птиц развиваются клетки, сходные с В-лимфоцитами человека. Хотя у человека не найдено органа, аналогичного сумке Фабрициуса, название связано с этой сумкой.

При развитии В-лимфоцитов из стволовой клетки они проходят несколько стадий и преобразуются в лимфоциты, способные образовывать плазматические клетки. Плазматические клетки в свою очередь образуют антитела и на их поверхности имеются иммуноглобулины трех классов: IgG, IgM и IgA (рис. 32).

Иммунный ответе виде продукции специфических антител происходит следующим образом: чужеродный антиген, проникнув в организм, прежде всего фагоцитируется макрофагами. Макрофаги, перерабатывая и концентрируя антиген на своей поверхности, передают информацию о нем Т-клеткам, которые начинают делиться, "созревают" и выделяют гуморальный фактор, включающий в антителопродукцию В-лимфоциты. Последние также "созревают", развиваются в плазматические клетки, которые и синтезируют антитела заданной специфичности.

Так, соединенными усилиями макрофаги, Т- и В-лимфоциты осуществляют иммунные функции организма - защиту от всего генетически чужеродного, в том числе и от возбудителей инфекционных болезней. Защита с помощью антител осуществляется таким образом, что синтезированные к данному антигену иммуноглобулины, соединяясь с ним (антигеном), подготавливают его, делают чувствительным к разрушению, обезвреживанию различными естественными механизмами: фагоцитами, комплементом и пр.

Контрольные вопросы

1. Какова роль макрофагов в иммунном ответе?

2. Какова роль Т-лимфоцитов в иммунном ответе?

3. Какова роль В-лимфоцитов в иммунном ответе?

Теории иммунитета . Значение антител в развитии иммунитета неоспоримо. Каков же механизм их образования? Этот вопрос в течение длительного времени является предметом споров и обсуждений.

Создано несколько теорий антителообразования, которые можно разделить на две группы: селективные (селекция - отбор) и инструктивные (инструктировать - наставлять, направлять).

Селективные теории предполагают существование в организме уже готовых антител к каждому антигену или клеток, способных синтезировать эти антитела.

Так, Эрлих (1898) предполагал, что клетка имеет готовые "рецепторы" (антитела), которые соединяются с антигеном. После соединения с антигеном, антитела образуются еще в большем количестве.

Такого же мнения придерживались создатели других селективных теорий: Н. Ерне (1955) и Ф. Бернет (1957). Они утверждали, что уже в организме плода, а затем и во взрослом организме имеются клетки, способные к взаимодействию с любым антигеном, но под влиянием определенных антигенов определенные клетки вырабатывают "нужные" антитела.

Инструктивные теории [Гауровитц Ф., Полинг Л., Ландштейнер К., 1937-1940] рассматривают антиген, как "матрицу", штамп, на котором формируются специфические группировки молекулы антител.

Однако эти теории не объясняли всех явлений иммунитета и в настоящее время наиболее принятой является клонально-селекционная теория Ф. Бернета (1964). Согласно этой теории в эмбриональном периоде в организме плода имеется множество лимфоцитов - клеток-предшественников, которые при встрече с собственными антигенами разрушаются. Поэтому во взрослом организме уже нет клеток для выработки антител к собственным антигенам. Однако, когда взрослый организм встречается с чужеродным антигеном, происходит селекция (отбор) клона иммунологически активных клеток и они вырабатывают специфические антитела, направленные против данного "чужого" антигена. При повторной встрече с этим антигеном клеток "отобранного" клона уже больше и они быстрее образуют большее количество антител. Эта теория наиболее полно объясняет основные явления иммунитета.

Механизм взаимодействия антигена и антител имеет различные объяснения. Так, Эрлих уподоблял их соединение реакции между сильной кислотой и сильным основанием с образованием нового вещества типа соли.

Бордэ считал, что антиген и антитела взаимно адсорбируют друг друга подобно краске и фильтровальной бумаге или йоду и крахмалу. Однако эти теории не объясняли главного - специфичности иммунных реакций.

Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") (рис. 33). Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты. Согласно гипотизе Полинга (см. рис. 33) антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.

При оптимальном соотношении антигена и антител образуются большие прочные комплексы, видимые простым глазом. При избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы. При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

На основании изложенных теорий специфичность реакции антиген - антитело сегодня представляют как взаимодействие детерминантной группы антигена и активных центров антитела. Так как антитела формируются под воздействием антигена, их структура соответствует детерминантным группам антигена. Детерминантная группа антигена и фрагменты активных центров антитела имеют противоположные электрические заряды и, соединяясь, образуют комплекс, прочность которого зависит от соотношения компонентов и среды, в которой они взаимодействуют.

Учение об иммунитете - иммунология - достигло за последние десятилетия больших успехов. Раскрытие закономерностей иммунного процесса позволило решить различные задачи во многих областях медицины. Разработаны и совершенствуются методы предупреждения многих инфекционных заболеваний; лечения инфекционных и ряда других (аутоиммунных, иммунодефицитных) болезней; предупреждения гибели плода при резус-конфликтных ситуациях; трансплантации тканей и органов; борьбы со злокачественными новообразованиями; иммунодиагностики - использования реакций иммунитета в диагностических целях.

Реакции иммунитета - это реакции между антигеном и антителом или между антигеном и сенсибилизированными * лимфоцитами, которые происходят в живом организме и могут быть воспроизведены в лабораторных условиях.

* (Сенсибилизированные - повышенно чувствительные. )

Реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX - начале XX века. В силу высокой чувствительности (улавливают антигены в очень больших разведениях) и, главное, строгой специфичности (позволяют отличить близкие по составу антигены) они нашли широкое применение в решении теоретических и практических вопросов медицины и биологии. Этими реакциями пользуются иммунологи, микробиологи, инфекционисты, биохимики, генетики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи и врачи других специальностей.

Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum - сыворотка) или гуморальными (от лат. humor - жидкость), потому что участвующие в них антитела (иммуноглобулины) всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами называются клеточными.

Контрольные вопросы

1. Как образуются антитела?

2. Какие Вы знаете теории образования антител?

3. Каков механизм взаимодействия антигена с антителом?

Серологические реакции

Серологические реакции - реакции взаимодействия между антигеном и антителом протекают в две фазы: 1-я фаза - специфическая - образование комплекса антигена и соответствующего ему антитела (см. рис. 33). Видимого изменения в этой фазе не происходит, но образовавшийся комплекс становится чувствительным к неспецифическим факторам, находящимся в среде (электролиты, комплемент, фагоцит); 2-я фаза - неспецифическая. В этой фазе специфический комплекс антиген - антитело взаимодействует с неспецифическими факторами среды, в которой происходит реакция. Результат их взаимодействия может быть видим невооруженным глазом (склеивание, растворение и т. п.). Иногда эти видимые изменения отсутствуют.

Характер видимой фазы серологических реакций зависит от состояния антигена и условий среды, в которой происходит его взаимодействие с антителом. Различают реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента и др. (табл. 14).

Применение серологических реакций . Одно из основных применений серологических реакций - лабораторная диагностика инфекций. Их используют: 1) для выявления антител в сыворотке больного, т. е. для серодиагностики; 2) для определения вида или типа антигена, например выделенного от больного микроорганизма, т. е. для его идентификации.

При этом неизвестный компонент определяют по известному. Например, для обнаружения антител в сыворотке больного берут известную лабораторную культуру микроорганизма (антиген). Если сыворотка реагирует с ним, значит она содержит соответствующие антитела и можно думать, что данный микроб является возбудителем болезни у обследуемого больного.

Если нужно определить, какой микроорганизм выделен, его испытывают в реакции с известной диагностической (иммунной) сывороткой. Положительный результат реакции говорит о том, что данный микроорганизм идентичен тому, которым иммунизировали животное для получения сыворотки (табл. 15).

Серологические реакции применяют также для определения активности (титра) сывороток и в научных исследованиях.

Проведение серологических реакций требует особой подготовки.

Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой. Применяют пробирки (бактериологические, агглютинационные, преципитационные и центрифужные), пипетки градуированные разного размера и пастеровские * , колбы, цилиндры, предметные и покровные стекла, чашки Петри, пластины из пластмассы с лунками.

* (Каждый ингредиент реакции разливают отдельной пипеткой. Пипетки следует сохранять до конца постановки опыта. Для этого удобно помещать их в стерильные пробирки с пометками, где какая пипетка. )

Инструменты и оборудование: петля, штативы, лупа, агглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифуга, весы химические с разновесом.

Материалы: антитела (иммунные и исследуемые сыворотки), антигены (культуры микроорганизмов, диагностикумы, экстракты, лизаты, гаптены, эритроциты, токсины), комплемент, изотонический раствор натрия хлорида.

Внимание! В серологических реакциях применяют только химически чистый натрия хлорид.

Сыворотки . Сыворотка больного. Сыворотку обычно получают на второй неделе болезни, когда можно ожидать наличие в ней антител, иногда пользуются сыворотками реконвалесцентов (выздоравливающих) и переболевших.

Чаще всего для получения сыворотки кровь берут из вены в количестве 3-5 мл в стерильную пробирку и направляют в лабораторию, сопровождая этикеткой, с указанием фамилии и инициалов больного, предполагаемого диагноза и даты.

Кровь следует брать натощак или не раньше чем через 6 ч после еды. В сыворотке крови после еды могут содержаться капельки жира, которые делают ее мутной и непригодной для исследования (такая сыворотка называется хилезной).

Внимание! При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре или ставят в термостат при 37° С на 30 мин для образования сгустка.

Внимание! Не следует держать сыворотку в термостате больше 30 мин - может произойти гемолиз, что помешает проведению исследований.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или петлей ("обводят"). Пробирку помещают в холодильник на некоторое время (обычно 1 ч, но не более 48 ч) для лучшего отделения сыворотки из сжавшегося на холоде сгустка. Затем сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой, снабженной резиновым баллоном или шлангом.

Отсасывать сыворотку следует очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы. Сыворотка должна быть совершенно прозрачной без примеси клеток. Мутные сыворотки еще раз отсасывают после того, как клетки осядут. Сыворотку можно освободить от форменных элементов центрифугированием.

Внимание! На сгустке сыворотка может оставаться не более 48 ч при + 4° С.

Для получения сыворотки кровь можно брать из прокола мякоти пальца или мочки уха пастеровской пипеткой. У грудных детей кровь берут из У-образного разреза на пятке.

При использовании пастеровской пипетки кровь насасывают в пипетку из прокола. Острый конец пипетки запаивают. Пипетку помещают в пробирку острым концом вниз. Чтобы он не сломался, на дно пробирки кладут кусочек ваты. Пробирку с соответствующей этикеткой направляют в лабораторию. Скопившуюся в широком конце пипетки сыворотку отсасывают.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном (вакциной). В полученной сыворотке определяют ее активность (титр), т. е. наибольшее разведение, в котором она реагирует с соответствующим антигеном в определенных условиях опыта.

Готовят сыворотки обычно на производстве. Их разливают в ампулы, на которых указывают название и титр. В большинстве случаев сыворотки высушивают. Сухую сыворотку перед употреблением растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема (тоже указан на этикетке). Хранят все сухие (лиофилизированные) диагностические" препараты при 4-10° С.

Для серологических исследований применяют иммунные сыворотки нативные (не адсорбированные) и адсорбированные. Недостаток нативных сывороток - наличие в них групповых антител, т. е. антител к микроорганизмам, имеющим общие антигены. Обычно такие антигены встречаются у микробов, принадлежащих к одной группе, роду, семейству. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью: реагируют только с гомологичным антигеном. Антитела к другим (гетерогенным) антигенам удалены адсорбцией. Титр антител адсорбированных сывороток низкий (1:40, 1:320), поэтому их не разводят * .

* (В настоящее время методом биотехнологии получены особые клетки (гибридомы), вырабатывающие in vitro моноклональные антитела, т. е. антитела, реагирующие строго специфично (с одним антигеном). )

Реакция агглютинации

Реакция агглютинация (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом. Для реакции необходимы:

1. Антитела (агглютинины) - находятся в сыворотке больного или в иммунной сыворотке.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический раствор.

Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб.

При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при диагностике кишечных инфекций, коклюша и др.

Подготовка ингредиентов: 1) получение сыворотки см. с. 200; 2) приготовление антигена. Взвесь живых микробов должна быть гомогенной и соответствовать (в 1 мл) примерно 30 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК. Для ее приготовления обычно используют 24-часовую культуру, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3-4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют ее густоту и, если нужно, разводят.

Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу и делает ее безопасной. Обычно пользуются диагностикумами, приготовленными на производстве.

Постановка реакции. Существует два метода проведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда ее называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках).

Реакция агглютинации на стекле . На обезжиренное предметное стекло наносят 2 капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:25. Капли на стекло наносят так, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Культуру петлей или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического раствора и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора, которая является контролем антигена.

Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, а в контроле антигена должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешана с сывороткой, появятся хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считают положительным. При отрицательном результате реакции в капле будет равномерная муть, как в контроле антигена.

Реакция отчетливее видна, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем свете. При ее изучении можно пользоваться лупой.

Развернутая реакция агглютинации . Готовят последовательные, чаще всего двукратные разведения сыворотки. Сыворотку больного обычно разводят от 1:50 до 1:1600, иммунную - до титра или до половины титра. Титр агглютинирующей сыворотки - ее максимальное разведение, в котором она агглютинирует гомологичные клетки.

Разведение сыворотки: 1) ставят в штатив нужное количество пробирок одинакового диаметра, высоты и конфигурации дна;

2) на каждой пробирке указывают степень разведения сыворотки, кроме того, на 1-й пробирке пишут номер опыта или название антигена. На пробирках контролей пишут "КС" - контроль сыворотки и "КА" - контроль антигена;

3) во все пробирки наливают по 1 мл изотонического раствора;

4) в отдельной пробирке готовят исходное (рабочее) разведение сыворотки. Например, для приготовления рабочего разведения 1:50, в пробирку наливают 4,9 мл изотонического раствора и 0,1 мл сыворотки. На пробирке обязательно указывают степень ее разведения. Исходное разведение сыворотки вносят в первые две пробирки и в пробирку контроля сыворотки;

5) готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

Примерная схема ее разведения приведена в табл. 16.

Примечание. Стрелки указывают перенос жидкости из пробирки в пробирку; из 5-й пробирки и пробирки контроля сыворотки 1,0 мл выливают в дезинфицирующий раствор.

Внимание! Во всех пробирках должен быть одинаковый объем жидкости.

После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносят по 1-2 капли антигена (диагностикума или свежеприготовленной взвеси бактерий). В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная муть. Контроль сыворотки остается прозрачным.

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37° С). Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный - спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре).

Учет результатов как всегда начинают с контролей. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, контроль антигена - равномерно мутным. Просматривают пробирки в проходящем свете (очень удобно на темном фоне) невооруженным глазом, с помощью лупы или агглютиноскопа.

Агглютиноскоп - прибор, состоящий из полой металлической трубки, укрепленной на подставке. Сверху на ней расположен окуляр с регулирующим винтом. Под трубкой прикреплено вращающееся зеркало. Пробирку с изучаемой жидкостью вставляют сбоку в отверстие трубки на такое расстояние, чтобы находящаяся в ней жидкость была под окуляром. Установив с помощью зеркала освещение и сфокусировав окуляр, определяют наличие и характер агглютината.

При положительном результате реакции в пробирках видны зерна или хлопья агглютината. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде "зонтика", а жидкость над осадком просветляется (сравните с равномерно мутным контролем антигена).

Для изучения величины и характера осадка содержимое пробирок слегка встряхивают. Различают мелкозернистую и хлопьевидную агглютинацию. Мелкозернистая (О-агглютинация) получается при работе с О-сыворотками * . Хлопьевидная (Н) - при взаимодействии подвижных микроорганизмов со жгутиковыми Н-сыворотками.

* (О-сыворотки содержат антитела к О (соматическому)-антигену, Н-сыворотки - к жгутиковому. )

Хлопьевидная агглютинация наступает быстрее, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный.

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный.

Осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакции слабо положительный.

Незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции.

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции.

Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации . 1. Спонтанная (самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-форме, не дают однородной (гомогенной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не дает спонтанной агглютинации.

2. В сыворотке здоровых людей имеются антитела к некоторым микроорганизмам (так называемые "нормальные антитела"). Титр их невысок. Поэтому положительный результат реакции в разведении 1:100 и выше говорит о ее специфичности.

3. Групповая реакция с близкими по антигенному строению микробами. Например, сыворотка больного брюшным тифом может также агглютинировать бактерии паратифа А и Б. В отличие от специфической групповая реакция идет в более низких титрах. Адсорбированные сыворотки не дают групповой реакции.

4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесенной болезни и даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются "анамнестическими". Чтобы отличить их от "инфекционных" антител, образующихся в течение текущей болезни, реакцию ставят в динамике, т. е. исследуют сыворотку больного, взятую повторно через 5-7 дней. Повышение титра антител говорит о наличии болезни - титр "анамнестических" антител не повышается, а может даже снизиться.

Контрольные вопросы

1. Что такое реакции иммунитета, каковы их основные свойства?

2. Какие компоненты участвуют в серологических реакциях? Почему реакции называют серологическими, из скольких фаз они состоят?

3. Что такое реакция агглютинации? Ее использование и методы проведения. Что такое диагностикум?

4. Каким антигеном пользуются при исследовании сыворотки больного? Какой сывороткой определяют вид неизвестного микроба?

5. Что такое О- и Н-агглютинация? В каких случаях образуется хлопьевидный осадок и когда мелкозернистый?

Задание

1. Поставьте развернутую реакцию агглютинации для определения титра антител в сыворотке больного и учтите ее результат.

2. Поставьте реакцию агглютинации на стекле для определения вида выделенного микроорганизма.

Реакция гемагглютинации

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации (РГА).

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита - эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Постановка реакции. Реакцию ставят в пробирках или на специальных пластинах с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объемом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят в термостат на 30 мин, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 мин.

Учет результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями ("зонтик"), покрывающий все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями ("пуговку"). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками "плюс". Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Высокая специфичность реакции торможения гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных двукратных разведениях от 1:10 до 1:2560 смешивают с равным объемом материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра, установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин, после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.

Реакцию сопровождают тремя контролями (табл. 17).

Учет результатов производят после повторной инкубации в термостате в течение 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться "пуговка" - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется "зонтик" - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется "пуговка" - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки - это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

Контрольные вопросы

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

Задание

Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.

Реакция преципитации

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК (рис. 35).

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента: 1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; взвесь микроорганизмов Основная 2. Антитело - сыворотка больного система 3. Комплемент - сыворотка морских свинок 4. Антиген - эритроциты барана Гемолити- 5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана ческая 6. Изотонический раствор система

Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложных компонентов, они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно весь опыт проводят в объемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Подготовка ингредиентов

1. Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта; объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте * .

* (Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. )

2. Эритроциты барана . Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте.

Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С (сенсибилизируют).

3. Комплемент обычно разводят 1:10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37° С. Схема титрования комплемента представлена в табл. 21.

Примечание. Общий объем жидкости в пробирках 2,5 мл.

Внимание! Титруют комплемент в таком же объеме, в каком ставят основной опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50 пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 мл × 50) и 15 мл изотонического раствора (0,3 мл × 50).

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т. е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в разведении от 1:10 до 1:160.

Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.

Внимание! Все компоненты готовят с небольшим избытком.

Проведение основного опыта

При постановке опыта крайне важна последовательность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы (табл. 22).

1 (В опыте сыворотку можно изучать в последовательных двукратных разведениях. )

Фаза I . В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С 45 мин - 1 ч или при 4° С ("РСК на холоде") 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции "на холоде" значительно повышает ее чувствительность и специфичность.

Фаза II . По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.

Учет результатов. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, следует немедленно вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.

Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.

В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.

Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.

Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае будет гемолиз.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

Полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;

Лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;

Лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;

Лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;

Лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.

Контрольные вопросы

1. В чем состоит принцип РСК?

2. Какие системы участвуют в РСК? Из чего состоит и какую роль в реакции выполняет гемолитическая система?

3. В чем состоит подготовка к основному опыту РСК? В какой последовательности его проводят? Сколько фаз в РСК?

4. О чем говорит отсутствие гемолиза в РСК?

Задание

1. Проведите титрование комплемента и установите его рабочую дозу.

2. Произведите расчет всех ингредиентов для постановки основного опыта, проведите опыт, учтите и зарисуйте результат.

Peaкция иммунофлюоресценции

В реакции иммунофлюоресценции (РИФ) используют люминесцентную микроскопию (см. главу 2) для серологических исследований. Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Такие сыворотки называются люминесцирующими * . Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры (можно обнаружить микроорганизмы непосредственно в материале от больного: кале при холере, мокроте при коклюше, мозговой ткани при бешенстве). Результат можно получить через полчаса после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки. Поэтому РИФ широко применяют при экспресс (ускоренной)-диагностике ряда инфекций.

* (Флюрохромы: флюоресцеин дает зеленое свечение, родамин - красное. )

Для приготовления препаратов предметное стекло с фиксированным мазком (отпечатком, срезом) помещают во влажную камеру. Камеру готовят следующим образом. На дно чашки Петри кладут влажную фильтровальную бумагу. На нее параллельно укладывают две стеклянные палочки (можно использовать широкую часть пастеровских пипеток). На них мазком вверх помещают предметное стекло.

Внимание! Не забудьте мазок с обратной стороны обвести восковым карандашом.

На мазок наносят каплю люминесцирующей сыворотки. Закрывают чашку и помещают в термостат или оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин. После инкубации промывают забуференным изотоническим раствором (рН 7,4), ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм!) и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы, гомологичные антителам люминесцирующей сыворотки, они ярко светятся на темном фоне. Этот метод называется прямой (рис. 36). Неудобство прямого метода РИФ состоит в том, что для его постановки необходимы люминесцирующие сыворотки к каждому определяемому антигену, готовить которые сложно, а полного набора готовых люминесцирующих сывороток к любому антигену нет. Поэтому пользуются часто непрямым методом. Он заключается в том, что на первом этапе препарат обрабатывают нелюминесцирующей иммунной специфической сывороткой к искомому антигену. В случае, если в препарате имеются искомые антигены (микробы), то образуется комплекс антиген - антитело, который увидеть нельзя. После высушивания, на втором этапе препарат обрабатывают люминесцирующей сывороткой, содержащей антитела не к искомому антигену, а к глобулинам того вида животного, от которого получена специфическая сыворотка. Например, если первая сыворотка получена при иммунизации кролика, то вторая должна содержать антитела к кроличьим глобулинам (см. рис. 36). Эти антитела соединяются с глобулинами специфической сыворотки, которые адсорбировались на искомом антигене, и комплекс светится при рассматривании препарата в люминесцентный микроскоп.

Опсонофагоцитарная реакция

Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) является одним из методов оценки активности иммунного фагоцитоза. Чем эта активность выше, тем выше устойчивость организма к инфекции. В иммунном организме под влиянием антител (опсонинов) фагоцитоз протекает активнее (поглощается большее количество микробов в более короткий срок). Поэтому показатели фагоцитарной активности имеют не только диагностическое значение (например, при бруцеллезе), но и позволяют прогнозировать исход инфекционного процесса, оценивать результаты лечения и вакцинации. Для реакции необходимы:

1. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов.

2. Антитело (опсонины) - исследуемая сыворотка.

3. Фагоциты - обычно нейтрофилы исследуемой крови.

Постановка реакции. С помощью микропипетки в небольшие пробирки наливают 0,05 мл 2% раствора натрия цитрата; 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 мл взвеси микроорганизмов, густота которой соответствует в 1 мл 10 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК.

Внимание! Для каждого ингредиента должна быть использована отдельная пипетка.

Содержимое пробирок перемешивают. Пробирки ставят в термостат на 30 мин, после чего вновь перемешивают их содержимое и готовят тонкие мазки (как мазки крови). Окрашивают по Романовскому - Гимзе.

Учет результатов. В разных местах мазка подсчитывают 25 нейтрофилов, учитывая в каждом из них количество захваченных микроорганизмов. Показатель опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по формуле:

ПОФР = 3а + 2б + 1с + 0,

где а - число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии; б - число нейтрофилов, содержащих от 21 до 40 бактерий; с - число нейтрофилов, содержащих от 1 до 20 бактерий; 0 - число нейтрофилов, не содержащих бактерии.

Максимальный показатель опсонофагоцитарной реакции при такой системе учета составляет 75.

Результат реакции оценивают по следующей схеме:

при ПОФР от 1 до 24 - слабоположительный;

при ПОФР от 25 до 49 - ясновыраженный;

при ПОФР от 50 до 75 - резкоположительный.

У здоровых людей ПОФР составляет 0-1, редко 4-5. Ясновыраженный и резкоположительный результаты реакции говорят о высоком опсонизирующем действии сыворотки обследуемого лица с выраженной активностью фагоцитов крови.

Определение только активности антител - опсонинов проводится опытом установления опсоиического индекса - отношения фагоцитарного показателя в присутствии иммунной (исследуемой) сыворотки к фагоцитарному показателю в сыворотке, заведомо не содержащей антител к данному микробу. Опыт ставят так: берут 2 пробирки, в одну из которых (опытную) вносят в равных количествах (обычно по 0,2 мл): 1) сыворотку обследуемого лица; 2) взвесь микробов, в котором определяют наличие опсонинов; 3) лейкоциты (можно из брюшной полости мыши). В контрольную пробирку вносят: 1) сыворотку без опсонинов (контрольную); 2) те же микробы, что и в опытную; 3) лейкоциты (те же, что и в опытную пробирку).

Обе пробирки выдерживают в термостате в течение 30 мин, а затем из той и другой готовят мазки, фиксируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе. Микроскопируют мазки и определяют фагоцитарный показатель в опытной и контрольной пробирках.

При наличии опсонинов в исследуемой сыворотке опсонический индекс будет больше единицы. Чем больше число, полученное от деления показателя фагоцитоза исследуемой на фагоцитарный показатель контрольной сыворотки, тем более выражено действие антител - опсонинов.

Контрольные вопросы

1. На каком свойстве антител основана ОФР? Специфична ли эта реакция?

2. О чем свидетельствует показатель ОФР, равный 75?

Задание

Исследуйте ОФР крови, взятой из пальца. Зарисуйте фагоциты. Вычислите ПОРФ.

Реакции иммунитета in vivo (кожаные пробы)

При нанесении антигена на скарифицированную кожу или введении внутрикожно можно выявить как иммунное состояние, так и состояние повышенной чувствительности к данному препарату.

Кожная проба с токсином . Внутрикожно вводят оттитрованное количество токсина. Если организм иммунен, т. е. обладает определенным уровнем антитоксина, действие токсина не проявится - произойдет нейтрализация токсина антитоксином. В неиммунном организме на месте введения токсина разовьется воспалительный инфильтрат (краснота, уплотнение и т. д.).

Кожные пробы с аллергеном (кожно-аллергические пробы) для изучения реакций повышенного типа (см. главу 13). При повышенной чувствительности немедленного типа введенный аллерген (антиген) вступает в реакцию с антителами, адсорбированными на клетках различных органов. Повышенная чувствительность замедленного типа обусловлена реакцией на аллерген сенсибилизированных Т-лимфоцитов. Такая сенсибилизация бывает при ряде инфекций у больных, переболевших и привитых (туберкулез, бруцеллез и др.). Поэтому кожно-аллергические пробы при этих инфекциях имеют диагностическое значение.

Препараты для кожных проб готовят специальные производства, снабжая инструкцией по их применению.

Контрольные вопросы

1. Что является антителом в кожной пробе с токсином? О чем свидетельствует отрицательный результат этой пробы?

2. Какая реакция позволяет выявить состояние повышенной чувствительности организма к инфекционному агенту?

Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных болезней

Попытки предупредить тяжелое течение смертельно опасной болезни, вызвав легкую форму заболевания, делались на протяжении столетий в разных странах мира.

Научное обоснование и практическое внедрение иммунопрофилактики впервые дал Л. Пастер, который создал принципы применения ослабленных (аттенуированных) микроорганизмов и приготовил препараты (вакцины) для предупреждения некоторых инфекционных заболеваний человека и животных.

Прошло более ста лет и в настоящее время искусственное создание иммунитета - основа борьбы с инфекционными заболеваниями.

Иммунизация - введение препаратов для создания искусственного активного иммунитета - проводится в определенные годы на протяжении всей жизни человека. В первые же дни после рождения ребенок получает вакцину БЦЖ против туберкулеза. На 1-м году жизни ему делают прививки, чтобы предупредить заболевания дифтерией, коклюшем и столбняком, вакцинируют против полиомиелита, кори и пр. Таким образом проводят специфическую профилактику инфекционных болезней, для которой используют вакцины.

Вакцины - препараты для активной иммунизации могут быть:

1. Корпускулярные (из микробных клеток) - живые и убитые.

2. Химические (антигены и антигенные фракции).

3. Анатоксины.

Живые аттенуированные вакцины готовят из живых микроорганизмов, вирулентность которых ослаблена (от лат. attenuer - ослаблять, смягчать), а иммуногенные свойства (способность вызывать невосприимчивость) сохранены.

Для получения таких микроорганизмов существуют разные способы:

1) выращивание на питательных средах, неблагоприятных для роста и размножения возбудителя; при действии физических и химических факторов (так была получена вакцина БЦЖ для профилактики туберкулеза); 2) пассирование возбудителя через организм животного, мало восприимчивого к воспроизводимой инфекции (так Л. Пастер получил вакцину против бешенства); 3) отбор естественных культур микроорганизмов, маловирулентных для человека (так получена вакцина против чумы) и др.

Живые вакцины создают напряженный иммунитет, так как вызывают процесс, сходный с естественным инфекционным, только слабо выраженный, почти без клинических проявлений. При этом приводится в действие весь механизм иммуногенеза - создается невосприимчивость.

Убитые вакцины - культуры микроорганизмов, инактивированные действием высокой температуры, химических веществ (фенол, формалин, спирт, ацетон), УФ-лучей и др. При этом подбирают такие факторы воздействия, которые полностью сохраняют иммуногенные свойства микробных клеток.

Химические вакцины - отдельные компоненты микробной клетки (антигены), полученные путем специальной обработки микробной взвеси.

Химические вакцины обычно быстро всасываются после введения в организм, что не позволяет достичь нужного иммуногенного раздражения, поэтому к вакцинам добавляют вещества, удлиняющие время всасывания: гидроксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, минеральные масла и др. Это называют созданием "депо".

Химические вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, менингита и др.

Анатоксины (от лат. ana - обратно) - это экзотоксины бактерий, обезвреженные воздействием формалина (0,3-0,4%) и выдерживанием при температуре 37° С в течение 3-4 нед. При этом происходит потеря токсических свойств, но сохранение иммуногенных.

В настоящее время получены и применяются анатоксины из токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др.

Анатоксины очищают от примесей питательных сред (балластные белки) и сорбируют на веществах, которые всасываются медленно из места введения.

По количеству антигенов, входящих в состав вакцины, различают: моновакцины (из одного вида антигенов), дивакцины (из двух антигенов), три вакцины (из трех антигенов) и т. д.

Ассоциированные вакцины готовят из антигенов различных бактерий и анатоксинов. Например, ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит убитые коклюшные микробы и анатоксины: дифтерийный и столбнячный.

Вакцины вводят внутримышечно, подкожно, накожно, внутрикожно, через рот. Иммунизируют либо однократно, либо двукратно и трехкратно с интервалами в 1-2 нед и больше. Кратность введения, интервалы между вакцинациями зависят от характера вакцины - для каждой разработаны схемы введения.

После введения вакцины могут возникнуть общие и местные реакции. К общим относятся повышение температуры (до 39° С), головная боль, недомогание. Эти явления обычно проходят через 2-3 дня. Местные реакции - краснота и инфильтрат на месте введения вакцины могут появиться через 1-2 дня после прививки. При накожном введении вакцины (против туляремии, БЦЖ и др.) появление местной реакции свидетельствует об эффективности прививки.

Существуют противопоказания для вакцинации: лихорадочное состояние, острые инфекционные заболевания, аллергия и др. Не прививают также женщин во второй половине беременности.

Вакцины и анатоксины готовят на предприятиях по производству бактерийных препаратов. Для их изготовления необходимы большие количества микробной взвеси (биомасса) или материала, содержащего вирусы.

Готовые препараты разливают в ампулы или флаконы и большей частью высушивают. Сухие препараты дольше сохраняют активность и другие свойства.

Некоторые вакцины, например полиомиелита, выпускают в виде таблеток или драже.

На каждую ампулу, флакон и коробку с препаратами наклеивают этикетки с указанием названия препарата, его объема, срока годности, номера серии и контрольного номера.

В каждую коробку кладут наставление по применению.

Хранят препараты в основном при температуре 4° С. Нельзя подвергать препараты замораживанию и оттаиванию, действию высокой температуры. При транспортировке соблюдают особые условия. Нельзя применять препараты, которые имеют трещины на ампулах и измененный внешний вид.

В СССР существует система Государственного контроля за качеством медицинских иммунобиологических препаратов, которая обеспечивает их эффективность и стандартность.

Особый вид вакцин - а у то вакцины. Их готовят в бактериологических лабораториях из микробов, выделенных от больного. Применяют аутовакцину для лечения только данного больного. Чаще всего используют аутовакцины для лечения хронически протекающих инфекций (стафилококковых и др.). Вводят аутовакцину многократно, малыми дозами по разработанной для каждой вакцины схеме. Аутовакцины стимулируют защитные силы организма, чем способствуют выздоровлению.

Сывороточные препараты применяют для создания искусственного пассивного иммунитета. К ним относят специфические иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Эти препараты содержат готовые антитела. Их получают из крови доноров - специально проиммунизированных людей или животных (против кори, гриппа, столбняка). Кроме того, используют сыворотку переболевших и даже здоровых людей, если в ней содержится достаточное количество антител. В качестве сырья для приготовления иммунных препаратов используют также плацентарную и абортную кровь.

Имеются антибактериальные и антитоксические сыворотки. Первые имеют более ограниченное применение. Антитоксические сыворотки применяют для лечения дифтерии, столбняка, ботулизма и др. Эти сыворотки выпускают с определенным содержанием антитоксина, которое измеряют в международных единицах (ME).

Иммунные сывороточные препараты получают из крови животных, главным образом лошадей, многократно иммунизированных. По окончании иммунизации определяют уровень антител в крови и делают кровопускание. Полученную сыворотку консервируют, контролируют ее стерильность, активность и физические свойства.

Препараты, полученные из крови лошадей, содержат чужеродные для человека белки, которые при повторном введении могут вызвать аллергические реакции: сывороточную болезнь и анафилактический шок. Для предупреждения осложнений сывороточные препараты следует вводить с предосторожностями (по Безредке) (см. главу 13). Для освобождения сывороток животных от балластных белков и концентрации антител применяют различные методы, основным из которых является метод "Диаферм-3", разработанный в нашей стране и включающий ферментативный гидролиз балластных белков.

Кроме того, для концентрации антител в меньшем объеме препарата разработаны методы выделения из сыворотки крови гамма-глобулинов, содержащих антитела. Такие препараты называют иммуноглобулинами. Их готовят из сыворотки человека (гомологичные) и животных (гетерологичные).

Эффективность иммуноглобулинов гораздо выше эффективности иммунных сывороток, а осложнений наблюдается несоизмеримо меньше. В настоящее время иммуноглобулины применяют гораздо более широко, чем сыворотки.

В нашей стране иммуноглобулины используют для профилактики кори, гепатита, краснухи и др. Профилактическое введение иммуноглобулинов проводят при подозрении на заражение или при заражении. Целесообразно вводить эти препараты в первые дни после заражения (начало инкубационного периода), пока патологический процесс еще не развился.

При лечебном применении препарата раннее его введение дает больший эффект.

Сыворотки и иммуноглобулины вводят внутримышечно и внутривенно.

Своевременное и правильное использование сывороточных препаратов позволяет снизить заболеваемость многими инфекциями.

Контрольные вопросы

1. Какие виды вакцин Вы знаете?

2. Какими препаратами создают пассивный иммунитет?

3. Что такое аутовакцина?

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;

Взаимодействие in vitro между специфическими антигенами и антителами называют иммунологической реакцией, которая состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab -фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

В микробиологии и иммунологии применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия специфических антигенов с антител и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Иммунологические реакции характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Серологический метод.

От латинского serum ¾ сыворотка: серология ¾ раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия АГ и AT сыворотки крови. Соответственно реакции АГ+АТ, происходящие in vitro, называются серологическими реакциями. Серология имеет огромное прикладное и практическое значение в современной клинической лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний.

Серологический метод исследования (диагностики) ¾ это метод, основанный на изучении сыворотки больного с целью определения в ней антител. В настоящее время понятие серологического метода расширено, так как разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение AT не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях: слюне, ликворе, биосекретах).

Основные характеристики:

1) взаимодействие АГ и AT строго специфично;

2) серологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и AT;

3) серологическая реакция имеет двухфазный характер:

· специфическое взаимодействие ¾ фаза невидимая;

· образование видимых комплексов ¾– для этого добавляют физиологический раствор;

4) серологическая реакция проходит по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

5) выделяется небольшое количество тепла.

Цели применения серологических реакций:

1) серологическая идентификация - это определение вида неизвестного АГ при помощи известных AT (иммунной диагностической сыворотки). В этом случае:

а) неизвестные АГ ¾ это микроорганизмы патогенные и непатогенные, токсины разного происхождения, белки крови, клетки разных органов и ткани другого вида или группы, клетки трансплантанта;

б) известные AT ¾ это стандартные препараты ¾ иммунные диагностические сыворотки (ИДС) специфичные определённому (искомому) АГ

2) серологическая диагностика (метод) ¾ это определение неизвестных AT в сыворотке крови или других биологических жидкостях больного с помощью известного АГ (диагностикума).

а) неизвестные AT ¾ это искомые AT сыворотки крови людей ¾ больных, переболевших, носителей, вакцинированных;

б) диагностикумы ¾ это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их АГ. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивацию проводят: нагреванием, формалином, спиртом и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет антигенные свойства).

Основные понятия серологии Диагностикум ¾взвесь убитых микробов. Титр антител ¾наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором произошла положительная реакция (агглютинации, связывания комплемента и т.п.). Диагностический титр ¾наименьший титр специфических антител у больного данной инфекцией человека, с которого реакция может считаться специфической (положительной). Парные сыворотки ¾двесыворотки одного пациента, первая из которых берется на 5-8 день заболевания, вторая ¾ через 10-14 дней, с целью оценить динамику иммунного ответа. Феномен нарастания титра антител ¾увеличение концентрации специфических антител в исследуемых парных сыворотках в 4 и более раз, свидетельствующее о наличие данного заболевания у человека в данный момент.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) (лат. agglutinatio ¾ склеивание) реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных (нерастворимых) антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: определения антител в сыворотке крови больных (например, при бруцеллезе ¾ реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекциях), идентификации возбудителя, выделенного от больного;

Для определения у больного антител ставятразвернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум и через 2 часа инкубации при 37 °С и 18-20 часов при комнатной температуре отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и Н-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении с физиологическим раствором 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без комков.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации , основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.

Двумя основными типами иммунных реакций являются врожденная реакция и адаптивная (приобретенная) реакция. Врожденная реакция , которая осуществляется с помощью нейтрофилов, макрофагов, тучных клеток и естественных киллеров, развивается быстро, является неспецифической и более старой с эволюционной точки зрения. Она не связана с образованием клеток памяти. Адаптивная приобретенная реакция, которая зависит от начального распознавания антигенов В- и Т-клетками, значительно более сложная, она возникает более медленно, является специфической, сопровождается образованием клеток памяти и считается более недавним эволюционным приобретением.

Иммунный ответ происходит в результате взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток и цитокинов. Он включает 4 фазы: распознавание антигена, активация, пролиферация и дифференцировка клеток.

Адаптивные механизмы, которые приводят к устранению антигенов, разделяются на гуморальный и клеточный иммунитет. Гуморальный иммунитет обеспечивается антителами, которые вырабатывают плазматические клетки, происходящие из клонов активированных В-лимфоцитов.

Клеточный иммунный ответ формируется при трансплантации органов и тканей, инфицировании вирусами, злокачественном опухолевом росте. Клеточный иммунитет проявляется двумя основными типами реакций - цитотоксичность и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) . В клеточном иммунитете участвует цитотоксическая клетка (Тк), реагирующая с антигеном в комплексе с белками МНС I класса в плазматической мембране клетки-мишени.

Цитотоксические реакции протекают следующим образом: цитотоксическая Т-клетка убивает клетку, инфицированную вирусом, в том случае, если она узнает с помощью своих рецепторов фрагменты вирусных белков, связанные с молекулами МНС I класса на поверхности зараженной клетки-мишени. Связывание цитотоксической клетки с клетками-мишенями ведет к высвобождению ими порообразующих белков, называемых перфоринами , которые полимеризуются в плазматической мембране клетки-мишени в присутствии Са 2+ , превращаясь в трансмембранные каналы (поры). Через эти поры внутрь клетки-мишени поступают другие белки, секретируемые Тк-гранзимы . Те, в свою очередь, активируют внутриклеточные ферменты каспазы . Последние включают сигналы для развития апоптоза. Сам Т-киллер защищен от цитотоксического действия перфорина. Механизм самозащиты неизвестен.

Реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). В этих реакциях принимают участие макрофаги и Тх. Эти реакции развиваются через несколько суток после воздействия антигена: происходит уплотнение и воспаление ткани в результате ее инфильтрации Т-лимфоцитами и макрофагами. ГЗТ вызывается Т-хелперами (СD4+), которые секретируют цитокины (ИФН-γ), активирующие макрофаги, и индуцируют воспаление (ФНО - фактор некроза опухоли).

При ГЗТ повреждение ткани происходит в результате действия продуктов активированных макрофагов, таких как гидролитических ферментов, промежуточных продуктов кислорода и цитокины. При хронических ГЗТ часто образуется фиброз как результат секреции цитокинов и факторов роста макрофагов.

Лекарства, косметические препараты могут соединятся с белками ткани, образуя комплексный антиген, с развитием контактной ГЗТ. Инфекционные болезни (бруцеллез, туляремия, туберкулез, лепра, токсоплазмоз, многие микозы и др.) сопровождаются развитием ГЗТ, поэтому при диагностики используют кожно-аллергические пробы с аллергенами возбудителей (например, реакция манту).

Гуморальный иммунный ответ (антителообразование) развивается в организме в ответ на антигены, расположенные внеклеточно. В нем участвуют макрофаги (антигенпрезентирующие клетки), Тх и В-лимфоциты. Данный ответ проходит следующим образом.

Попавший в организм антиген поглощается макрофагом. Макрофаг расщепляет его на фрагменты, которые в комплексе с молекулами МНС класса II появляются на поверхности клетки. Такая обработка антигена макрофагом называется процессированием антигена.

Для дальнейшего развития иммунного ответа на антиген необходимо участие Тх(хелперов). Но прежде Тх должны быть активированы сами. «Узнавание» Тх-клеткой комплекса «антиген + молекула МНС II класса» на поверхности макрофага стимулирует секрецию интерлейкина-1 (ИЛ-1) макрофагом. Под воздействием ИЛ-1 активизируются синтез и секреция ИЛ-2 Тх-клеткой. Выделение Тх-клеткой ИЛ-2 стимулирует ее пролиферацию Тх (хелперов). Такой процесс может быть расценен как аутокринная стимуляция, так как клетка реагирует на тот агент, который сама синтезирует и секретирует. Увеличение численности Тх необходимо для реализации оптимального иммунного ответа.

Тх активируют В-клетки путем секреции ИЛ-2. Активация В-лимфоцита происходит также при прямом взаимодействии антигена с иммуноглобулиновым рецептором В-клетки. В-лимфоцит сам процессирует антиген и представляет его фрагмент в комплексе с молекулой МНС II класса на клеточной поверхности. Этот комплекс узнает уже задействованный в иммунной реакции Тх (рисунок 11). Узнавание рецептором Тх-клетки комплекса «АГ + молекула МНС II класса» на поверхности В-лимфоцита приводит к секреции Тх-клеткой интерлейкинов - ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, γ-ИФН (γ-интерферона), под действием которых В-клетка размножается и дифференцируется с образованием плазматических клеток и В-клеток памяти. Так, ИЛ-4 инициирует активацию В-клетки, ИЛ-5 стимулирует пролиферацию активированных В-клеток, ИЛ-6 вызывает созревание активированных В-клеток и превращение их в плазматические клетки, секретирующие антитела.

Интерферон привлекает и активирует макрофаги, которые начинают более активно фагоцитировать и разрушать внедрившиеся микроорганизмы.

Передача большого количества переработанных макрофагом антигенов обеспечивает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов в направлении образования плазмоцитов, вырабатывающих специфи-ческие антитела на конкретный вид антигена (рисунок 13).

Подводя итог, следует отметить: клеточные и гуморальные реакции не работают автономно. Как правило, в организме одновременно реализуются оба типа иммунного ответа. Распознавание Т- и В-клетками различных по своей природе антигенов, многообразие реакций и форм ответа обеспечивают в целом мощную защиту организма в течение его жизни.

Ниже приведены рисунки, где показаны взаимодействия иммуннокомпетентных клеток при клеточном и гуморальном иммунитете.

Рисунок 13 - Основные процессы, происходящие при иммунной реакции

Иммунологические методы исследования – диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для:

Определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов,

Видовой принадлежности белка,

Распознавания аллергии и аутоиммунных болезней,

Беременности,

Гормональных нарушений, а также

В научно-исследовательской работе.

Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе И. м. и. изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек - носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.