Реакция агглютинации и ее варианты. Варианты ускоренных реакций агглютинации. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты. Методы генного зондирования

1.1. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат) в виде хлопьев.

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки. Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена. Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О– антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов. v

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О– антиген и жгутиковый Н– антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя. v

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного.

Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке. v

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

ВАРИАНТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ (ПЛАСТИНЧАТАЯ) РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 – 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной – сыворотка остается равномерно мутной.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА, РПГА)

Реакция ставится: 1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается, или 2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)–группы крови человека).

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.

Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят – 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. v

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном – оседают в виде пуговки или колечка.

1.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ. ЛИЗИСА,
ОПСОНО–ФАГОЦИТАРНАЯ РЕАКЦИЯ, РЕАКЦИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ЭКЗОТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция. Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина. Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина. Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток – в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре. Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента. Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ)

Определенные формы антигена при повторном контакте с организмом могут вызвать реакцию, специфическую в своей основе, но включающую неспецифические клеточные и молекулярные факторы острого воспалительного ответа. Известны две формы повышенной реактивности: гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Первый тип реакции проявляется при участии антител, при этом реакция развивается не позднее 2 ч после повторного контакта с аллергеном. Второй тип реализуется с помощью Т–клеток воспаления, (Тгзт) как основных эффекторов реакции, обеспечивающих накопление в зоне воспаления макрофагов, реакция проявляется через 6–8 ч и позже.

Развитию реакции гиперчувствительности предшествует встреча с антигеном и возникновение сенсибилизации, т.е. появление антител, активно сенсибилизированных лимфоцитов и пассивно сенсибилизированных цитофильными антителами других лейкоцитов (макрофагов, гранулоцитов).

Реакции гиперчувствительности имеют три фазы развития: иммунологическую; патохимическую; патофизиологическую.

В первой, специфической, фазе аллерген взаимодействует с антителами и (или) сенсибилизированными клетками. Во второй фазе происходит выброс биологически активных веществ из активированных клеток. Освободившиеся медиаторы (гистамин, серотонин, лейкотриены, брадикинин и др.) вызывают различные периферические эффекты, свойственные соответствующему типу реакции – третья фаза.

Реакции повышенной чувствительности четвертого типа

Реакции этого типа обусловлены патогенными межклеточными взаимодействиями сенсибилизированных Т–хелперов, цитотоксических Т–лимфоцитов (Т–киллеров) и активированных клеток системы мононуклеарных фагоцитов, вызванных длительной стимуляцией системы иммунитета бактериальными антигенами, при которой возникает относительная недостаточность системы иммунитета организма элиминировать из внутренней среды бактериальные возбудители инфекционных заболеваний. Данные реакции повышенной чувствительности обуславливают туберкулезные каверны легких, их казеозный некроз и общую интоксикацию у пациентов с туберкулезом. Кожный грануломатоз при туберкулезе и проказе в морфопатогенетическом отношении во многом составляется реакциями повышенной чувствительности четвертого типа.

Наиболее известный пример реакции повышенной чувствительности четвертого типа – это реакция Манту, развивающаяся в месте внутрикожного введения туберкулина больному, организм и система которого сенсибилизированы к антигенам микобактерий. В результате реакции образуется плотная гиперемированная папула с некрозом в центре, которая появляется только через несколько часов (замедленно) после внутрикожного введения туберкулина. Формирование папулы начинается с выхода из сосудистого русла в межклеточные пространства мононуклеарных фагоцитов циркулирующей крови. Одновременно начинается эмиграция из сосудистого русла полиморфонуклеаров. Затем инфильтрация нейтрофилами спадает, и инфильтрат начинает преимуще ственно состоять из лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов. Этим реакция Манту отличается от реакции Артюса, при которой в месте поражения накапливаются преимущественно полиморфонуклеарные лейкоциты.

При реакциях повышенной чувствительности четвертого типа длительная стимуляция антигенами сенсибилизированных лимфоцитов приводит в местах патологических изменении тканей к патологически интенсивному и длительному высвобождению Т–хелперами цитокинов. Интенсивный выброс цитокинов в локусах тканевых повреждений обуславливает гиперактивацию находящихся там клеток системы мононуклеарных фагоцитов, многие из которых в гиперактивированном состоянии образуют тяжи эпителиоидных клеток, а некоторые сливаются между собой с образованием гигантских клеток. Макрофаги, на поверхности которых экспонированы бактериальные и вирусные антигены могут уничтожаться через функционирование Т–киллеров (натуральных киллеров).

Реакция повышенной чувствительности четвертого типа индуцируется распознаванием чужеродного бактериального антигена сенсибилизированными по отношению к нему Т–хелперами. Необходимое условие распознавания – взаимодействие индукторов с антигенами, экспонированными на поверхности антиген–презентирующих клеток после эндоцитоза и переработки мононуклеарными фагоцитами чужеродных иммуногенов. Еще одно необходимое условие – экспонирование антигенов в комплексе с молекулами I класса из главного комплекса тканевой совместимости. После распознавания антигена сенсибилизированные хелперы высвобождают цитокины и, в частности, интерлейкин–2, активирующий натуральные киллеры и мононуклеарные фагоциты. Активированные мононуклеарные фагоциты высвобождают протеолитические ферменты и свободные кислородные радикалы, что повреждает ткани.

Кожно–аллергические пробы – тесты на установление сенсибилизации организма к аллергенам, определение его инфицированности, например, туберкулезом, бруцеллезом, уровня коллективного иммунитета, например, к туляремии. По месту введения аллергена различают: 1) накожные пробы; 2) скарификационные; 3) внутрикожные; 4) подкожные. Клиническая реакция на аллерген при кожно–аллергической пробе подразделяются на местные, общие и очаговые, а также на немедленные и замедленные.

Местные реакции медиаторного типа ГНТ возникают через 5–20 мин, выражаются в виде эритемы и волдыря, исчезают через несколько часов, оцениваются плюсовым методом по величине эритемы, измеряемой в мм. Местные реакции ГЗТ возникают через 24–48 ч, держатся долго, проявляются в виде инфильтрата, иногда с некрозом в центре, оцениваются по величине инфильтрата в мм, также по плюсовой системе. При цитотоксическом и иммунокомплексном типах ГНТ гиперемия и инфильтрация отмечаются через 3–4 ч, достигают максимума на 6–8 ч и затихают примерно через сутки. Иногда наблюдаются комбинированные реакции.

1.3. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения.

По механизму РСК протекает в две фазы:

1. Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим (взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента).
2. Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым (выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка).

Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген–антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.

Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной – при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК. Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

1.4. ДНК–ЗОНДЫ. ПОЛИМЕРАЗНО–ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР),
ИММУНО–ФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной методической базы генетических исследований явились основой генетической инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК, так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации – образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А–Т, Г–Ц).

Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку, позволяющую идентифицировать образование комплекса.

Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены).

Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК– или РНК–зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного микроорганизма), как правило представленные в виде генетических последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда – препараты РНК, особенно часто – рибосомальная РНК. В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом авидин–фермент) и т. п.

Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда

В настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты.

В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего – полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК– или РНК–зонда предварительно проводится его получение и введение метки.

Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное «подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола.

Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот фиксируют на носителе – нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80° С в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.

После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры.

Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых – холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация insitu).

Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (ПЦР). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro. Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНК–полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры – два типа олигонуклеотидов величиной 20–25 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5–3, а второй – копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНК–копий.

Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40–55°С.

Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.

Реакция амплификации позволяет существенно повысить чувствительность анализа при генном зондировании, что особенно важно при низкой концентрации инфекционного агента.

Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией является возможность исследования субмикроскопического количества патологического материала.

Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного материала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов. Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики инфекционных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.

Методы ИФА и РИФ в большей степени носят качественный или полуколичественный характер. При очень низких концентрациях компонентов образование комплекса антиген – антитело не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными средствами. Индикация комплекса антиген – антитело в таких случаях может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов – антиген или антитело – ввести метку, которую можно легко детектировать в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого вещества.

В качестве метки могут использоваться радиоактивные изотопы (например, 125I), флюоресцентные вещества, ферменты.

В зависимости от используемой метки различают радиоиммуный (РИА), флюоресцентный иммунный (ФИА), иммуноферментый (ИФА) методы анализа и др. В последние годы широкое практическое применение получил ИФА, что связано с возможностью количественных определений, высокой чувствительности, специфичности и автоматизации учета.

Иммуноферментные методы анализа – группа методов, которые позволяют выявить комплекс антиген – антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом с появлением окраски.

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген – антитело с измеряемой ферментной меткой. Антиген или антитело, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субстрата под действием фермента можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген – антитело. Фермент в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально.

Ферменты представляют собой очень удобные метки, поскольку их каталитические свойства позволяют им действовать в качестве усилителей, так как одна молекула фермента может способствовать образованию более 1?105 молекул продукта каталитической реакции в минуту. Необходимо подобрать такой фермент, который длительно сохраняет свою каталитическую активность, не теряет ее при связывании с антигеном или антителом, и обладает высокой специфичностью по отношению к субстрату.

Основные способы получения антител или антигенов, меченых ферментом, – конъюгатов: химические, иммунологические и генно–инженерные. Для постановки ИФА наиболее часто используются ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, галактозидаза и др.

Для выявления активности фермента в комплексе антиген–антитело с целью визуального и инструментального учета реакции используют хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Так, для выявления активности пероксидазы хрена в твердофазном ИФА в качестве субстрата используют 5–аминосалициловую кислоту, дающую интенсивное коричневое окрашивание, орто–фенилендиамин, образующий оранжево–желтое окрашивание. Для выявления активности щелочной фосфатазы и?–галатозидазы используют нитрофенилфосфаты и нитрофенилгалактозиды соответственно.

Результат реакции при образовании окрашенного продукта определяют визуально или с помощью спектрофотометра, измеряющего поглощение света с определенной длиной волны.

Известно много вариантов постановки ИФА. Различают гомогенный и гетерогенный варианты.

По методике постановки различают конкурентный и неконкурентный методы ИФА. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если на первой стадии присутствуют анализируемое соединение (антиген) и его аналог (меченый ферментом антиген), конкурирующие между собой за связывание с имеющимися в недостатке центрами специфического связывания (антителами), то метод является конкурентным. В этом случае чем больше исследуемого антигена содержит раствор, тем меньше количество связывающихся меченых антигенов.

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.

Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ – лучах комплекс

Микроб сыворотка, меченная флюорохромом

Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина – ФИТЦ

При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.

Постановка РИФ

На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ–меченных антител.

Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 20–25 мин, или в термостате при 37°С в течение 15 мин.

Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа или люминесцентной насадки к обычному оптическому микроскопу.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.

Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации . РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза . РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.

Компоненты реакции:

1. Антиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный , нерастворимый антиген ). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная ), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.

2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека . Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках , которые называются агглютинирующими сыворотками . Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.

3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.

Способы постановки РА.

1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена , капля сыворотки без микробов – контроль антитела , капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината . Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.

2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.

При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках.Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Методы постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция коагглютинации

Развернутая РА на стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.

Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

Осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.

Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37). Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя , выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

Рис. 7.37 а,б . Реакция агглютинации с IgM -антителами (а) и IgG -антителами (б )

1. Определение возбудителя, выделенного от больного Ориентировочная реакция агглютинации на стекле (рис. 7.38). К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Рис. 7.38.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного (рис. 7.39). К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

Рис. 52

2. Определение антител в сыворотке крови больного
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного (рис. 7.39). К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
3. Реакция агглютинации для определения групп крови Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (И), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).

Таблица 7.6. Определение групп крови АВО

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Методы постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция коагглютинации

Развернутая РА на стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.

Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

Осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции