Реакции в иммунологии. Лекция по микробиологии "Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний". реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью опр

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig) in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

2.7 Серологические реакции: цели постановки, общая классификация.

Цели постановки :

а) для идентификации антигена:

в патологическом материале (экспресс-диагностика);

в чистой культуре:

серологическая идентификация (определение вида);

серотипирование (определение серовара);

б) для выявления антител (Ig):

наличия (качественные реакции);

количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

Общая классификация серологических реакций:

а) простые (2-х компонентные: Ag + Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag + Ig + C);

в) с использованием метки.

2.8 Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

а) с корпускулярным антигеном:

пластинчатая;

объемная;

непрамая:

латекс-агглютинация;

ко-агглютинация;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) = пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция преципитации:

а) с растворимым антигеном:

объемная (например, реакция кольцепреципитации);

в геле (иммунодиффузия):

простая (по Манчини);

двойная или встречная (по Оухтерлони);

реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) (например реакция флокулляции);

другие варианты:

1. иммуноэлектрофорез;

   иммуноблотинг.

Сложные серологические реакции (3–х компонентные: Aг+Ig+C):

а) видимые:

иммобилизация;

иммунного прилипания;

лизиса (в том числе гемолиза);

б) невидимые:

реакция связывания комплемента (РСК).

2.10 Реакции с использованием метки:

РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

ИФА – иммуноферментный анализ;

РИА – радиоиммунный анализ;

ИЭМ – иммунная электронная микроскопия.

Иммунный ответ. КИО. ГИО

4 Клеточный иммунный ответ

Иммунный ответ (ИО)– это комплекснаястадийная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию .

По механизмам эффекторного действия различают ИО:

– гуморальный (обеспечивается В- системой иммунитета),

– клеточный (обеспечивается Т-системой иммунитета).

В отличие от В-системы иммунитета , которая нейтрализует антиген с помощью антител,

–Т-система иммунитета уничтожает антигены, представленные на клетках, через прямое взаимодействие субпопуляции T-клеток – специфических цитотоксических T-клеток (=CD8 T-клеток = T-киллеров) с измененными собственными или чужеродными клетками;

–Т-клетки распознают не собственно антигенный пептид (эпитоп) , а его комплекс с молекулами МНС I или МНС II .

Реакции КИО лежат в основе:

реакции отторжения трансплантанта,

аллергической реакции замедленного типа,

противоопухолевого иммунитета,

Этапы КИО:

поглощение и процессинг АГ

В качестве антигенпрезентирующих (АПК) клеток в КИО участвуют дендритные клетки или макрофаги.

Процессинг сводится к:

– расщеплению исходной молекулы до уровня специфических пептидов,

– активации синтеза в АПК антигенов МНС I или II классов,

– образованию комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса и к экспрессии его на мембране АПК.

презентация АГ:

– комплекс антигенный пептид + МНС I презентируется для опознания прецитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом CD8+;

комплекс антигенный пептид + МНС II - Т-хелперам, имеющим фенотип CD4+.

– узнавание Т-клеточным рецептором (TCR) комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса. При этом важную роль играют адгезивные молекулы CD28 на Т-лимфоцитах и CD80 (CD86) – на АПК, выполняющие функцию корецепторов;

активация Т-лимфоцитов – переход из стадии покоя в стадию G 1 клеточного цикла. Условие активации – передача сигнала от клеточной мембраны к ядру. В результате образуется ряд транскрипционных молекул, активирующих гены важнейших цитокинов. Синтезируются ИЛ2 и рецептора для него – ИЛ2R, гамма-интерферон (γИФН) и ИЛ4.

Пролиферация – размножение специфического по отношению к данному антигену клона Т-лимфоцитов (клональная экспансия ) под действие ИЛ2. Лишь размножившийся клон лимфоцитов способен выполнять функции по элиминации антигена.

Дифференцировка – процесс специализации функций клеток внутри специфического клона:

– под действием γИФН активируется процесс синтеза антигенпрезентирующими клетками ИЛ12, который воздействует на исходные специфические Т-хелперы нулевые (Th0) и тем самым способствует их дифференцировке в Тh1.

– Th1 продуцируют γИФН, ИЛ2 и факторы некроза опухоли альфа- и бета- , а также контролируют развитие клеточного иммунного ответа, и гиперчувствительности замедленного типа.

эффекторная фаза – уничтожение клетки-мишени. Происходит активация киллерной функции прецитотоксических лимфоцитов (специфических киллеров), натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов. ПреЦТЛ дифференцируются в ЦТЛ, экспрессируя рецепторы к ИЛ2.

ЦТЛ убивают внутриклеточные бактерии и простейшие, инфицированные вирусами клетки, а также клетки опухоли и аллогенного трансплантата.

Каждый ЦТЛ способен лизировать несколько чужеродных клеток-мишеней.

Этот процесс осуществляется в три стадии:

распознавание и контакт с клетками-мишенями;

летальный удар – перфорины и цитолизины действуют на мембрану клетки-мишени и образуют в ней поры;

лизис клетки-мишени – через образовавшиеся под влиянием перфоринов и цитолизинов поры проникает вода, разрывающая клетки.

Схема клеточного иммунного ответа

Закономерности развития гуморального иммунного ответа на проникновение тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов.

Протекание процесса презентации АГ лимфоциту зависит от типа антигена. Все АГ делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые. Большинство антигенов тимусзависимые. Презентация тимуснезависимого антигена проходит по схеме: М––>Вл. Презентация тимусзависимого антигена проходит по схеме: М––>Тх2––> Вл.

Тимуснезависимый антигенов мало. Они являются сильными митогенами. Должны быть полимеризованного характера и иметь большое количество одинаковых эпитопов (например: липополисахариды клеточной Гр(-) микроорганизмов). На поверхности В-лимфоцитов очень большое число антигенраспознающих рецепторов одной специфичности. Эти рецепторы подвижные. Как только на них действует липополисахарид, происходит агрегация рецепторов, приводящая к концентрированию их в одном месте в виде «шапочки» – это первый сигнал к активации В-лимфоцитов. Второй сигнал В-лимфоциты получают от макрофага в виде медиатора, которым является ИЛ1. После этого происходит активация В-лимфоцита и трансформация его в бластные клетки; они увеличиваются в размере, 6-7 раз делятся и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулин малой специфичности IgМ.

Тимуснезависимый антиген индуцирует пролиферацию клона клеток с АГ-специфическими рецепторами. Особенностью ИО в данном случае заключается в следующем: 1) не происходит переключения синтеза IgМ на синтез иммуноглобулинов класса G и др. классов; 2) тормозится ИО, т.к. не образуются клетки памяти; 3) быстро возникает иммунологическая толерантность.

Тимусзависимые антигены вызывают ИО, включающий следующие стадии: 1) Презентация антигена Т-хелперу; 2) специфическое распознание Т-хелпером антигена на поверхности макрофага через антигенраспознающий рецептор. Распознание идет в комплексе с молекулами HLA–DR. На этом этапе, получив антигенную информацию от макрофага, Т-хелпер получает медиаторный сигнал от макрофага в виде ИЛ-1. Это активирует Т-хелпер. Активированный Т-хелпер выделяет различные лимфокины (ИЛ-2,ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, митогенный и бластогенный фактор), что способствует экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов для ИЛ-2 и ИЛ-4. Это продукты самого Т-хелпера, которые поддерживают его в активном состоянии. Кроме этого, эти продукты активируют В-лимфоциты вместе с ИЛ-1, который В-лимфоцит получает от макрофага.

Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

ПЛАН:

Виды иммунных реакций.

Условия проведения серологических реакций.

Требования к сыворотке.

Понятие положительный и отрицательный результат.

ОНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

Виды иммунных реакций.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig)

in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

Серологические реакции: 1) определение, 2) фазы, 3) цели постановки, 4) общая классификация.

1) Определение

Серологические методы исследования (от лат. Serum - сыворотка и logos - учение) с помощью реакции антиген-антитело.

2) Фазы

2 фазы взаимодействия:

I. Специфическая (видимая) – наступает быстро, aнтитела соединяются с соответствующими им антигенами. В эту фазу взаимодействуют детерминантные группы антигенов (АГ) и активных центров антител (АТ).

В образовании комплекса АГ+ АТ участвуют силы:

Кулона;

Ван дер Ваальса

Водородные связи.

Никаких видимых изменений в этой фазе нет. При электронной микроскопии комплекс АГ+АТ в виде решетки.

II. Неспецифическая – наступает медленно, образовавшийся комплекс антиген – антитело реагирует с дополнительным неспецифическим фактором среды, в которых происходит реакция, и это видимо глазом – склеивание, растворение, выпадение хлопьев осадка и т. п. В присутствии электролита снижается заряд, уменьшается растворимость, образуются видимые конгломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

3) Цели постановки :

а) для идентификации антигена (антитело известно-диагностическая сыворотка):

• в патологическом материале (экспресс-диагностика);

  в чистой культуре:

  1. серологическая идентификация (определение вида);

     серотипирование (определение серовара) – определение штамма;

б) для выявления антител (Ig) (антиген известен-диагностикум):

• наличия (качественные реакции);

  количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

4) Общая классификация серологических реакций :

а) простые (2-х компонентные: Ag+Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag+Ig+C);

в) с использованием метки.

Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

Реакция агглютинации (РА) - иммунная реакция взаимодействия суспензии АГ (эритроцитов, бактерий) с АТ в физиологическом растворе.

При агглютинации происходит склеивание частиц АТ с образованием хлопьевидного осадка.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, в которой используют антительный или антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности АТ или АГ).

Эритроциты в этой реакции выполняют роль пассивных носителей.

Оценка результатов РПГА проводится следующим образом:

- при положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно U- или V-образной лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»);

- при отрицательной реакции (отсутствии агглютинации) эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют при диагностике вирусных инфекций. Некоторые вирусы содержат на своей поверхности белок гемагглютинин, склеивающий эритроциты. Добавление специфических противовирусных АТ блокирует вирусный гемагглютинин - гемагглютинация отсутствует.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакцию Кумбса, применяют для определения неполных АТ. Добавление антиглобулиновой сыворотки (АТ против Ig человека) усиливает результаты реакции. РНГА применяют при определении резус-фактора.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1) антиген (агглютиноген) АГ;

2) антитело (агглютинин) АТ;

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул-тел (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

РА используют для:

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены).

Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации).

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки ( известные АТ ).

Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Компоненты:

1. стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки (АТ);

2. исследуемая чистая культура от пациента;

3. физ.раствор.

В исследуемой чистой культуре антигены (АГ) в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Пример:

Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят каплями:

1 дизентерии ;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа ;

(1-2 диагностические сыворотки)
3 -я капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа (определялись антигены).

Для определения АТ в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум , содержащий взвесь известных микробов или их антигенов АГ .

Определение групп крови системы АВО (реакция гемагглютинации (РГА)) – агглютинируют эритроциты.

Компоненты реакции:

1. АГ (эритроциты крови) исследуемая кровь

2. АТ (эритротесты- цоликлоны)

Набор цоликлонов:

Реагент Цоликлон анти-А (розовый)

Реагент Цоликлон анти-В (синий)

Реагент Цоликлон анти-АВ (бесцветный)

3. электролит (физиологический раствор)

Техника определения:

1 .

В лунки планшета наносится по одной капле (0,1 мл) цоликлона анти - А, анти - В и анти – АВ (для контроля).

2.

Рядом с каждой каплей реагента наносится маленькую (0,05-0,01 мл) каплю исследуемой крови.

Затем капля цоликлона смешивается с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой.

3.

Реакция агглютинации развивается в течение первых 3-5 секунд при мягком покачивании пластинки.

Результаты реакции учитываются через 2,5 - 3 минуты после смешивания капель. Слева направо в лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.

Положительный результат-появление зернистого осадка (агглютината).

положительная РА (+)

Отрицательный - осадка нет.

отрицательная РА(-)

4.

Анализ результатов.

O (I ) α β – агглютинации нет

A (II ) β – агглютинация с анти-А

B (III ) α – агглютинация с анти-В

AB (IV )О – агглютинация с анти-А, с анти-В

Схематичное изображение агглютинации.

Антигены АГ на эритроцитах (определяемые) + антитело АТ (цоликлон) диагностическая сыворотка

Учет агглютинации в планшетах

Реакция преципитации:

Реакция преципитации - иммунная реакция взаимодействия АГ в растворимом состоянии с АТ в физиологическом растворе.

При преципитации происходит образование макромолекулярного иммунного комплекса, что проявляется переходом прозрачного коллоидного раствора в непрозрачную суспензию, или преципитат.

Количество обоих реагентов должно быть в строго определенных соотношениях, так как избыток одного из них снижает результат.

Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

1. Реакцию кольцепреципитации ставят в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый АГ. АГ и АТ смешиваются за счет теплового движения молекул, и они взаимодействуют. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо непрозрачного преципитата.

2. Реакцию двойной иммунодиффузии по Оухтерлони проводят в агаровом геле, в лунки которого вносят по схеме либо раствор АГ, либо раствор АТ. АГ и АТ диффундируют в гель навстречу друг другу и при положительном результате реакции образуют иммунные комплексы, видимые как линии преципитации.

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты РА:

преципитирующая сыворотка (известное АТ-преципитин);

исследуемая сыворотка (неизвестный АГ-преципитиноген);

физ. Раствор.

Реакцию преципитации ставят в или в специальных узких пробирках (реакция кольцепреципитации), или в чашках Петри в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцеприципитации

Постановка и учет результатов реакции кольцепреципитации для обнаружения возбудителя сибирской язвы (Асколи реакция).

Постановка .

1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ растворе5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта). Фильтруют.

2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку.

3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт).

Учет .

В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична

С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Реакция преципитации в агаре

Постановка и учет результатов реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии)

Постановка

Ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри.

1. Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой .

2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры .

В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная , должна быть заведомо токсигенной .

Посевы помещают в термостат.

Учет

Анализ проводят через 24-48-72 ч.

Положительный результат - (культура токсигенная) - на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата , « стрелы-усики », которые хорошо видны в проходящем свете.

На рисунке представлена реакция преципитации в агаре на определение токсигенности дифтерийных палочек. Средние культуры не образовали «стрел-усиков», это не токсикогенные возбудители.

Штаммы возбудителя дифтерии могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.

При заболевании все возбудители дифтерии тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре

Сложные серологические реакции ( 3–х компонентные:Aг+Ig+C):

Реакция связывания комплемента (РСК).

Реакцию проводят в два этапа.

На первом этапе АТ взаимодействуют с АГ и комплементом, на втором этапе добавляют индикатор - гемолитическую систему (смесь эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки).

При положительном результате на первом этапе АТ образуют с АГ иммунный комплекс, связывающий комплемент реакционной смеси.

В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на втором этапе, не разрушаются.

В противном случае несвязанный комплемент вызывает лизис индикаторных эритроцитов.

Для ее проведения необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система) (рис.1).

Реакция протекает в две фазы (рис. 3).

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает (рис).

Результат опыта оценивают (рис.2), отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь).

Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 4. Постановка и результат РСК.

Вывод: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса.

Диагностическое значение имеет:

четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) ;

двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Реакции с использованием метки :

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлуоресценции основана на световой индикации комплекса антиген-антитело

Иммуноферментный анализ.

Современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;

2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);

3) исследование гормонального статуса пациента;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

На рисунке твердофазный ИФА – известные АГ (слева) адсорбировн а на лунке планшета, (справа) на лунках планшета известные АТ

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя., конъюгированных с ферментом-меткой.

Постановка ИФА (общий механизм):

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Компоненты реакции:

1. АГ(АТ) известное – на лунке планшета.

2. АТ (АГ) исследуемое.

3. АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)

4.хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент

5. стоп раствор

Основные этапы проведения ИФА

1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Образуется комплекс.

2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ первого этапа. Фермент активизируется.

3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный цвет раствора.

4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.

Учет.

Положительный результат- изменение цвета, на рисунке – желтый цвет.

Иммунохроматографический анализ

Метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых».

К преимуществам ИХА следует отнести:

Быстроту и легкость в использовании;

Малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

Дешевизну для производителя и потребителя;

Возможность производства тестов в больших объемах;

Простоту чтения и интерпретации результата;

Высокую чувствительность и вопроизводимость;

Возможность количественного определения;

Возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

Возможность мультианализа.

Компоненты (нанесены на тест-полоску):

1. Конъюгат с меткой коллоидного золота – специфичен к определяемому АГ.

2. АТ тестовой линии – специфичны к комплексу АТ-АГ

3. АТ контрольной линии – специфичны к конъюгату.

Постановка ИХА:

1.Нанесение образца на обозначенный стартовый участок полоски.

2. Получение результата в виде появления окрашенных полос на месте тестовой и контрольной линии.

Учет

Положительный – при окрашивании тестовой линии.

Отрицательный - при отсутствии окрашивания тестовой линии.

Недостоверный – при отсутствии окрашивания контрольной линии.

Общий механизм ИХА:

1. Образец вносится на стартовое поле (подушку образца) и связывается с конъюгатом (специфичное тело с цветной меткой), которые находятся на подушке конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс.

2. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с АТ тестовой линии. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоса.

3. Не связавшиеся на тестируемой полосе АТ (конъюгат) движется дальше и достигает контрольной линии, связывается с АТ контрольной линии. В результате появляется вторая окрашенная полоса. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.

2. Условия проведения серологических реакций.

1. Наличие гомологичных – соответствующих друг другу антигена и антитела.

2. Чистая, сухая посуда.

3. Определенное соотношение препаратов (чаще всего равное).

4. Обязательное присутствие электролита (изотонический раствор NaCl).

5. рН нейтральный или близкий к слабощелочному.

6. Температура +37°С или комнатная (обязательно плюсовая).

7. Проводится контроль антигена и контроль сыворотки (антител).

3 Требования к сыворотке

Сыворотка должна быть совершенно прозрачная без примеси клеток

Получают на 2 неделе болезни обычно, когда уже есть в наличии антитела.

Кровь берут в количестве 3-5 мл натощак или через 6 ч. после еды.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре или центрифугируют. Отсасывают сыворотку очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определённой схеме соответствующим антигеном (вакциной). Готовят сыворотки обычно на производстве.

4. Понятие положительный и отрицательный результат.

РА.

При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями (см. рисунки выше).

РП.

При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета (см. рисунки выше).

ИФА.

Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

РСК.

Задержка гемолиза - реакция положительна; если комплемент свободен, наблюдается гемолиз - реакция отрицательна (см. рисунки выше).

Результаты реакции Вассермана:

а - полная задержка гемолиза (+ + ++);

б - выраженная задержка гемолиза (+ ++);

в - частичная задержка гемолиза (++);

г - слабая задержка гемолиза (+);

д - полный гемолиз (-).

Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Домашнее задание:

1. Изучите материал

Составьте 3 конспекта по видео

Понятие иммунитет обозначает невосприимчивость организма ко всяким генетически чужеродным агентам, в том числе и болезнетворным микроорганизмам и их ядам (от лат. immunitas - освобождение от чего-либо).

При попадании в организм генетически чужеродных структур (антигенов) приходит в действие целый ряд механизмов и факторов, которые распознают и обезвреживают эти чуждые для организма субстанции.

Система органов и тканей, осуществляющая защитные реакции организма против нарушения постоянства его внутренней среды (гомеостаза), называется иммунной системой.

Наука об иммунитете - иммунология изучает реакции организма на чужеродные вещества, в том числе и микроорганизмы; реакции организма на чужеродные ткани (совместимость) и на злокачественные опухоли; определяет иммунологические группы крови и т. д. Основы иммунологии были заложены стихийными наблюдениями древних о возможности искусственного предохранения человека от заразной болезни. Наблюдения за людьми, находившимися в очаге эпидемии, привели к заключению, что заболевают не все. Так, не болеют чумой выздоровевшие от этой болезни; корью обычно болеют один раз в детстве; перенесшие коровью оспу, не болеют натуральной и т. п.

Известны способы древних народов предохранять от укуса змеи, втирая в насечки на коже растения, растертые со змеиным ядом; защищать стада от перипневмонии скота, делая также насечки на коже кинжалом, предварительно погруженном в легкие быка, погибшего от этого заболевания.

Впервые искусственную прививку с целью предупреждения инфекции произвел Э. Дженнер (1876). Однако только Л. Пастер сумел научно обосновать принципы искусственной защиты от инфекционных болезней. Он доказал, что заражение ослабленными возбудителями ведет к невосприимчивости организма при повторных встречах с этими микроорганизмами.

Пастер разработал препараты, предохраняющие от заболевания сибирской язвой и бешенством.

Дальнейшее развитие иммунология получила в работах И. И. Мечникова о значении клеточного иммунитета (фагоцитоза) и П. Эрлиха о роли гуморальных факторов (жидкостей организма) для развития невосприимчивости.

В настоящее время иммунология - это наука, в которой защита от инфекционных болезней является лишь одним из звеньев. Она объясняет причины совместимости и отторжения тканей при пересадке органов, гибель плода при резус-конфликтной ситуации, осложнения при переливании крови, решает задачи судебной медицины и т. п.

Основные виды иммунитета представлены на схеме.

Наследственный (видовой) иммунитет

Наследственный (видовой) иммунитет - это наиболее прочная и совершенная форма невосприимчивости, которая обусловлена передающимися по наследству факторами резистентности (устойчивости).

Известно, что человек невосприимчив к чуме собак и рогатого скота, а животные не болеют холерой и дифтерией. Однако наследственный иммунитет не абсолютен: создавая особые, неблагоприятные условия для макроорганизма, можно изменить его невосприимчивость. Например, перегрев, охлаждение, авитаминоз, действие гормонов приводят к развитию заболевания, которое обычно человеку или животному несвойственно. Так, Пастер, охлаждая кур, вызывал у них при искусственном заражении заболевание сибирской язвой, которой они в обычных условиях не болеют.

Приобретенный иммунитет

Приобретенный иммунитет у человека формируется в течение жизни, по наследству он не передается.

Естественный иммунитет . Активный иммунитет формируется после перенесенного заболевания (его называют постинфекционным). В большинстве случаев он длительно сохраняется: после кори, ветряной оспы, чумы и др. Однако после некоторых заболеваний длительность иммунитета невелика и не превышает одного года (грипп, дизентерия и др.). Иногда естественный активный иммунитет развивается без видимого заболевания. Он формируется в результате скрытой (латентной) инфекции или многократного инфицирования небольшими дозами возбудителя, не вызывающими явно выраженного заболевания (дробная, бытовая иммунизация).

Пассивный иммунитет - это иммунитет новорожденных (плацентарный), приобретенный ими через плаценту в период внутриутробного развития. Новорожденные могут также получить иммунитет с молоком матери. Этот вид иммунитета непродолжителен и к 6-8 мес, как правило, исчезает. Однако значение естественного пассивного иммунитета велико - он обеспечивает невосприимчивость грудных детей к инфекционным заболеваниям.

Искусственный иммунитет . Активный иммунитет человек приобретает в результате иммунизации (прививок). Этот вид иммунитета развивается после введения в организм бактерий, их ядов, вирусов, ослабленных или убитых разными способами (прививки против коклюша, дифтерии, оспы).

При этом в организме происходит активная перестройка, направленная на образование веществ, губительно действующих на возбудителя и его токсины (антитела). Происходит также изменение свойств клеток, уничтожающих микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Развитие активного иммунитета происходит постепенно в течение 3-4 нед и сохраняется он сравнительно длительное время - от 1 года до 3-5 лет.

Пассивный иммунитет создают введением в организм готовых антител. Этот вид иммунитета возникает сразу после введения антител (сывороток и иммуноглобулинов), но сохраняется всего 15-20 дней, после чего антитела разрушаются и выводятся из организма.

Понятие "местный иммунитет" было введено А. М. Безредкой. Он считал, что отдельные клетки и ткани организма обладают определенной восприимчивостью. Иммунизируя их, создают как бы барьер для проникновения возбудителей инфекции. В настоящее время доказано единство местного и общего иммунитета. Но значение невосприимчивости отдельных тканей и органов к микроорганизмам несомненно.

Помимо указанного выше разделения иммунитета по происхождению, различают формы иммунитета, направленные на разные антигены.

Антимикробный иммунитет развивается при заболеваниях, обусловленных различными микроорганизмами или при введении корпускулярных вакцин (из живых ослабленных или убитых микроорганизмов).

Антитоксический иммунитет вырабатывается по отношению к бактериальным ядам - токсинам.

Антивирусный иммунитет формируется после вирусных заболеваний. Этот вид иммунитета большей частью длительный и стойкий (корь, ветряная оспа и др.). Антивирусный иммунитет развивается также при иммунизации вирусными вакцинами.

Кроме того, иммунитет можно разделить в зависимости от периода освобождения организма от возбудителя.

Стерильный иммунитет . Большинство возбудителей исчезает из организма при выздоровлении человека. Этот вид иммунитета называют стерильным (корь, оспа и др.).

Нестерильный иммунитет . Восприимчивость к возбудителю инфекции сохраняется только в период пребывания его в организме хозяина. Такой иммунитет называют нестерильным или инфекционным. Этот вид иммунитета наблюдают при туберкулезе, сифилисе и некоторых других инфекциях.

Контрольные вопросы

1. Что такое иммунитет?

2. Какие Вы знаете формы иммунитета?

Невосприимчивость человека к инфекционным заболеваниям обусловлена совместным действием неспецифических и специфических факторов защиты.

Неспецифическими называют врожденные свойства организма, которые способствуют уничтожению самых различных микроорганизмов на поверхности тела человека и в полостях его организма.

Развитие специфических факторов защиты происходит после соприкосновения организма с возбудителями или токсинами; действие этих факторов направлено только против этих возбудителей или их токсинов.

Неспецифические факторы защиты организма

Существуют механические, химические и биологические факторы, предохраняющие организм от вредных воздействий различных микроорганизмов.

Кожа . Неповрежденная кожа является барьером для проникновения микроорганизмов. При этом имеют значение механические факторы: отторжение эпителия и выделения сальных и потовых желез, которые способствуют удалению микроорганизмов с кожи.

Роль химических факторов защиты также выполняют выделения желез кожи (сальных и потовых). Они содержат жирные и молочные кислоты, обладающие бактерицидным (убивающим бактерии) действием.

Биологические факторы защиты обусловлены губительным воздействием нормальной микрофлоры кожи на патогенные микроорганизмы.

Слизистые оболочки разных органов являются одним из барьеров на пути проникновения микроорганизмов. В дыхательных путях механическая защита осуществляется с помощью мерцательного эпителия. Движение ресничек эпителия верхних дыхательных путей постоянно передвигает пленку слизи вместе с различными микроорганизмами по направлению к естественным отверстиям: ротовой полости и носовым ходам. Такое же воздействие на бактерий оказывают волоски носовых ходов. Кашель и чиханье способствуют удалению микроорганизмов, предотвращают их аспирацию (вдыхание).

В слезах, слюне, материнском молоке и других жидкостях организма содержится лизоцим. Он оказывает губительное (химическое) действие на микроорганизмы. Также влияет на микроорганизмы кислая среда желудочного содержимого.

Нормальная микрофлора слизистых оболочек, как фактор биологической защиты, является антагонистом патогенных микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1. Что такое неспецифические факторы защиты?

2. Какие факторы препятствуют проникновению патогенных микроорганизмов через кожу и слизистые оболочки?

Воспаление - реакция макроорганизма на чужеродные частицы, проникающие в его внутреннюю среду. Одной из причин воспаления является внедрение в организм возбудителей инфекции. Развитие воспаления приводит к уничтожению микроорганизмов или освобождению от них.

Воспаление характеризуется нарушением циркуляции крови и лимфы в очаге поражения. Оно сопровождается повышением температуры, отеком, краснотой и болевыми ощущениями.

Клеточные факторы неспецифической защиты

Фагоцитоз

Одним из основных механизмов воспаления является фагоцитоз - процесс поглощения бактерий.

Явление фагоцитоза впервые описано И. И. Мечниковым. Он начал изучение фагоцитоза от одноклеточной амебы, для которой фагоцитоз является способом усвоения пищи. Проследив этот процесс на разных ступенях развития животного мира, И. И. Мечников завершил его открытием специализированных клеток человека, с помощью которых происходит уничтожение бактерий, рассасывание мертвых клеток, очагов кровоизлияний и т. д. Так было создано учение о фагоцитозе, которое и сегодня имеет огромное значение.

Фагоцитарной активностью обладают различные клетки организма (лейкоциты крови, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов). Наиболее выражена эта активность у подвижных полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов крови и тканевых макрофагов, в меньшей степени - у клеток костного мозга. Все одноядерные фагоцитирующие клетки (и их костномозговые предшественники) объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ).

Фагоцитирующие клетки имеют лизосомы, в которых находится более 25 различных гидролитических ферментов и белков, обладающих антибактериальными свойствами.

Стадии фагоцитоза . Этап 1 - приближение фагоцита к объекту за счет химического влияния последнего. Это движение называют положительным хемотаксисом (в сторону объекта).

Этап 2 - прилипание микроорганизмов к фагоцитам.

Этап 3 - поглощение микроорганизмов клеткой, образование фагосомы.

Этап 4 - образование фаголизосомы, куда поступают ферменты и бактерицидные белки, гибель и переваривание возбудителя.

Процесс, который заканчивается гибелью фагоцитированных микробов, называется завершенным фагоцитозом.

Однако некоторые микроорганизмы, находясь внутри фагоцитов, не погибают, а иногда даже размножаются в них. Это - гонококки, микобактерии туберкулеза, бруцеллы. Такое явление называют незавершенным фагоцитозом; при этом погибают фагоциты.

Как и другие физиологические функции, фагоцитоз зависит от состояния организма - регулирующей роли центральной нервной системы, питания, возраста.

Фагоцитарная деятельность лейкоцитов изменяется при многих и часто неинфекционных заболеваниях. Определяя ряд показателей фагоцитоза, можно установить течение болезни - выздоровление или ухудшение состояния больного, эффективность проводимого лечения и пр.

Для оценки функционального состояния фагоцитов чаще всего определяют поглотительную активность по двум тестам: 1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих клеток (число лейкоцитов с поглощенными микробами из 100 наблюдаемых); 2) фагоцитарное число - среднее количество поглощенных одним лейкоцитом микробов или других объектов фагоцитоза.

Бактерицидные возможности фагоцитов определяют по числу лизосом, активности внутриклеточных ферментов и другими методами.

Активность фагоцитоза связана с наличием в сыворотке крови антител - опсонинов. Эти антитела усиливают фагоцитоз, готовят поверхность клетки к поглощению ее фагоцитом.

Активность фагоцитоза в значительной степени определяет невосприимчивость организма к тому или иному возбудителю. При одних заболеваниях фагоцитоз является основным фактором защиты, при других - вспомогательным. Однако во всех случаях отсутствие фагоцитарной способности клеток резко ухудшает течение и прогноз заболевания.

Клеточная реактивность

Развитие инфекционного процесса и формирование иммунитета полностью зависят от первичной чувствительности клеток к возбудителю. Наследственный видовой иммунитет - пример отсутствия чувствительности клеток одного вида животных к микроорганизмам, патогенным для других. Механизм этого явления изучен недостаточно. Известно, что реактивность клеток меняется с возрастом и под влиянием различных факторов (физических, химических, биологических).

Контрольные вопросы

1. Что такое фагоцитоз?

2. Какие стадии фагоцитоза Вы знаете?

3. Что такое завершенный и незавершенный фагоцитоз?

Гуморальные факторы неспецифической защиты

Помимо фагоцитов, в крови находятся растворимые неспецифические вещества, губительно действующие на микроорганизмы. К ним относятся комплемент, пропердин, β-лизины, х-лизины, эритрин, лейкины, плакины, лизоцим и др.

Комплемент (от лат. complementum - дополнение) представляет собой сложную систему белковых фракций крови, обладающую способностью лизировать микроорганизмы и другие чужеродные клетки, например эритроциты. Различают несколько компонентов комплемента: С 1 , С 2 , С 3 и т. д. Комплемент разрушается при температуре 55° С в течение 30 мин. Это свойство называется термолабильностью. Он разрушается также при встряхивании, под влиянием УФ-лучей и т. п. Помимо сыворотки крови, комплемент обнаружен в различных жидкостях организма и в воспалительном экссудате, но отсутствует в передней камере глаза и спинномозговой жидкости.

Пропердин (от лат. properde - подготовлять) - группа компонентов нормальной сыворотки крови, активирующая комплемент в присутствии ионов магния. Он сходен с ферментами и играет важную роль в устойчивости организма к инфекции. Снижение уровня пропердина в сыворотке крови свидетельствует о недостаточной активности иммунных процессов.

β-лизины - термостабильные (устойчивые к действию температуры) вещества сыворотки крови человека, обладающие антимикробным действием, в основном по отношению к грамположительным бактериям. Разрушаются при 63° С и под действием УФ-лучей.

Х-лизин - термостабильное вещество, выделенное из крови больных с высокой температурой. Обладает способностью без участия комплемента лизировать бактерии, главным образом грамотрицательные. Выдерживает нагревание до 70-100° С.

Эритрин выделен из эритроцитов животных. Оказывает бактериостатическое действие на возбудителей дифтерии и некоторые другие микроорганизмы.

Лейкины - бактерицидные вещества, выделенные из лейкоцитов. Термостабильны, разрушаются при 75-80° С. Обнаруживаются в крови в очень небольших количествах.

Плакины - сходные с лейкинами вещества, выделенные из тромбоцитов.

Лизоцим - фермент, разрушающий оболочку микробных клеток. Он содержится в слезах, слюне, жидкостях крови. Быстрое заживление ран конъюнктивы глаза, слизистых оболочек полости рта, носа объясняется в значительной степени наличием лизоцима.

Бактерицидными свойствами обладают также составные компоненты мочи, простатическая жидкость, экстракты различных тканей. В нормальной сыворотке содержится в небольшом количестве интерферон.

Контрольные вопросы

1. Что такое гуморальные факторы неспецифической защиты?

2. Какие гуморальные факторы неспецифической защиты Вы знаете?

Специфические факторы защиты организма (иммунитет)

Перечисленные выше компоненты не исчерпывают всего арсенала факторов гуморальной защиты. Главными среди них являются специфические антитела - иммуноглобулины, образующиеся при введении в организм чужеродных агентов - антигенов.

Антигены

Антигены - генетически чужеродные для организма вещества (белки, нуклеопротеиды, полисахариды и др.), на введение которых организм отвечает развитием специфических иммунологических реакций. Одна из таких реакций - образование антител.

Антигены обладают двумя основными свойствами: 1) иммуногенностью, т. е. способностью вызывать образование антител и иммунных лимфоцитов; 2) способностью вступать с антителами и иммунными (сенсибилизированными) лифоцитами в специфическое взаимодействие, которое проявляется в виде иммунологических реакций (нейтрализации, агглютинации, лизиса и др.). Антигены, обладающие обоими признаками, называются полноценными. К ним относятся чужеродные белки, сыворотки, клеточные элементы, токсины, бактерии, вирусы.

Вещества, не вызывающие иммунологических реакций, в частности выработку антител, но вступающие в специфическое взаимодействие с готовыми антителами, получили название гаптенов - неполноценных антигенов. Гаптены приобретают свойства полноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными веществами - белками, полисахаридами.

Условиями, определяющими антигенные свойства различных веществ, являются: чужеродность, макромолекулярность, коллоидное состояние, растворимость. Проявляется антигенность при попадании вещества во внутреннюю среду организма, где происходит встреча его с клетками иммунной системы.

Специфичность антигенов, способность их соединяться только с соответствующим антителом - уникальное биологическое явление. Оно лежит в основе механизма сохранения постоянства внутренней среды организма. Это постоянство обеспечивает иммунная система, распознающая и уничтожающая генетически чужеродные вещества (в том числе и микроорганизмы, их яды), находящиеся в его внутренней среде. Иммунная система человека несет постоянный иммунологический надзор. Она способна распознавать чужеродность при отличии клетки всего по одному гену (раковые).

Специфичность - особенность строения веществ, по которой антигены отличаются друг от друга. Она определяется антигенной детерминантой, т. е. небольшим участком молекулы антигена, который и соединяется с антителом. Число таких участков (группировок) у разных антигенов различно и определяет число молекул антител, с которыми может соединяться антиген (валентность).

Способность антигенов соединяться только с теми антителами, которые возникли в ответ на активацию иммунной системы данным антигеном (специфичность), используется в практике: 1) диагностика инфекционных болезней (определение специфических антигенов возбудителя или специфических антител в сыворотке крови больного); 2) профилактика и лечение больных инфекционными болезнями (создание невосприимчивости к определенным микробам или токсинам, специфическая нейтрализация ядов возбудителей ряда болезней при иммунотерапии).

Иммунная система четко дифференцирует "свои" и "чужие" антигены, реагируя только на последние. Однако возможны реакции на собственные антигены организма - аутоантигены и возникновение против них антител - аутоантител. Аутоантигенами становятся "забарьерные" антигены - клетки, вещества, которые в течение жизни идивидуума не контактируют с иммунной системой (хрусталик глаза, сперматозоиды, щитовидная железа и др.), а приходят в соприкосновение с ней при различных повреждениях, всасываясь обычно в кровь. А поскольку при развитии организма эти антигены не распознавались как "свои", то не сформировалась естественная толерантность (специфическая иммунологическая безответность), т. е. в организме остались клетки иммунной системы, способные к иммунному ответу на эти собственные антигены.

В результате появления аутоантител могут развиться аутоиммунные заболевания как следствие: 1) прямого цитотоксического действия аутоантител на клетки соответствующих органов (например, зоб Хасимото - повреждение щитовидной железы); 2) опосредованного действия комплексов аутоантиген - аутоантитело, которые откладываются в поражаемом органе и вызывают его повреждение (например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит).

Антигены микроорганизмов . Микробная клетка содержит большое число антигенов, имеющих разное расположение в клетке и разное значение для развития инфекционного процесса. У разных групп микроорганизмов антигены имеют различный состав. У кишечных бактерий хорошо изучены О-, К-, Н-антигены.

О-антиген связан с клеточной стенкой микробной клетки. Его обычно называли "соматическим", так как считали, что этот антиген заключен в теле (соме) клетки. О-антиген грамотрицательных бактерий - сложный липополисахаридно-протеиновый комплекс (эндотоксин). Он термостабилен, не разрушается при обработке спиртом и формалином. Состоит из основного ядра (core) и боковых полисахаридных цепей. Специфичность О-антигенов зависит от строения и состава этих цепей.

К-антигены (капсульные) связаны с капсулой и клеточной стенкой микробной клетки. Их называют также оболочечными. К-антигены расположены более поверхностно, чем О-антигены. Они являются главным образом кислыми полисахаридами. Имеется несколько видов К-антигенов: А, В, L и др. Эти антигены отличаются друг от друга по устойчивости к температурным воздействиям. А-антиген наиболее устойчив, L - наименее. К поверхностным антигенам относят и Vi-антиген, который имеется у возбудителей брюшного тифа и некоторых других кишечных бактерий. Он разрушается при 60° С. Наличие Vi-антигена связывали с вирулентностью микроорганизмов.

Н-антигены (жгутиковые) локализуются в жгутиках бактерий. Они представляют собой особый белок - флагеллин. Разрушаются при нагревании. При обработке формалином сохраняют свои свойства (см. рис. 70).

Протективный антиген (защитный) (от лат. protectio - покровительство, защита) образуется возбудителями в организме больного. Возбудители сибирской язвы, чумы, бруцеллеза способны образовывать протективный антиген. Его обнаруживают в экссудатах пораженных тканей.

Выявление антигенов в патологическом материале является одним из способов лабораторной диагностики инфекционных болезней. Для выявления антигена применяют различные иммунные реакции (см. ниже).

При развитии, росте и размножении микроорганизмов их антигены могут меняться. Происходит утрата некоторых антигенных компонентов, более поверхностно расположенных. Это явление носит название диссоциации. Примером ее может служить "S" - "R"-диссоциация.

Контрольные вопросы

1. Что такое антигены?

2. Каковы основные свойства антигенов?

3. Какие антигены микробной клетки Вы знаете?

Антитела

Антитела - это специфические белки крови - иммуноглобулины, образующиеся в ответ на введение антигена и способные специфически реагировать с ним.

В сыворотке человека имеется два вида белков: альбумины и глобулины. Антитела связаны в основном с глобулинами, измененными под воздействием антигена и названными иммуноглобулинами (Ig). Глобулины неоднородны. По скорости движения в геле при пропускании через него электрического тока их делят на три фракции: α, β, γ. Антитела принадлежат главным образом к γ-глобулинам. Эта фракция глобулинов имеет наибольшую скорость движения в электрическом поле.

Иммуноглобулины характеризуют по молекулярной массе, скорости осаждения при ультрацентрифугировании (центрифугировании с очень большой скоростью) и т. п. Различия этих свойств позволили разделить иммуноглобулины на 5 классов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Все они играют роль в развитии иммунитета против инфекционных заболеваний.

Иммуноглобулины G (IgG) составляют около 75% всех иммуноглобулинов человека. Они наиболее активны в развитии иммунитета. Единственные из иммуноглобулинов проникают через плаценту, обеспечивая пассивный иммунитет плода. Имеют небольшую молекулярную массу и скорость осаждения при ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины М (IgM) образуются в организме плода и первыми появляются после заражения или иммунизации. К этому классу принадлежат "нормальные" антитела человека, которые образуются в течение его жизни, без видимого проявления инфекции или при бытовом многократном инфицировании. Имеют большую молекулярную массу и скорость осаждения при ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины A (IgA) обладают способностью проникать в секреты слизистых (молозиво, слюна, содержимое бронхов и др.). Они играют роль в защите слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов от микроорганизмов. По величине молекулярной массы и скорости осаждения при ультрацентрифугировании близки к IgG.

Иммуноглобулины Е (IgE) или реагины несут ответственность за аллергические реакции (см. главу 13). Играют роль в развитии местного иммунитета.

Иммуноглобулины D (IgD). Обнаружены в небольшом количестве в сыворотке крови. Изучены недостаточно.

Структура иммуноглобулинов . Молекулы иммуноглобулинов всех классов построены одинаково. Наиболее простая структура у молекул IgG: две пары полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью (рис. 31). Каждая пара состоит из легкой и тяжелой цепи, различающихся по молекулярной массе. Каждая цепь имеет постоянные участки, которые предопределены генетически, и переменные, образующиеся под воздействием антигена. Это специфические участки антитела называют активными центрами. Они вступают во взаимодействие с антигеном, который вызвал образование антител. Количество активных центров в молекуле антитела определяет валентность - число молекул антигена, с которым может связаться антитело. IgG и IgA - двухвалентны, IgM - пятивалентны.

Иммуногенез - антителообразование зависит от дозы, кратности и способа введения антигена. Различают две фазы первичного иммунного ответа на антиген: индуктивную - от момента введения антигена до появления антителообразующих клеток (до 20 ч) и продуктивную, которая начинается к концу первых суток после введения антигена и характеризуется появлением антител в сыворотке крови. Количество антител постепенно увеличивается (к 4-му дню), достигая максимума на 7-10-й день и уменьшается к концу первого месяца.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении антигена. При этом индуктивная фаза значительно короче - антитела вырабатываются быстрее и интенсивнее.

Контрольные вопросы

1. Что такое антитела?

2. Какие Вы знаете классы иммуноглобулинов?

Клеточные механизмы иммунного ответа

Лимфоидные клетки организма выполняют основную функцию в развитии иммунитета - невосприимчивости, не только по отношению к микроорганизмам, но и ко всем генетически чужеродным клеткам, например при пересадке тканей. Лимфоидные клетки обладают способностью отличать "свое" от "чужого" и устранять "чужое" (элиминировать).

Родоначальницей всех клеток иммунной системы является кроветворная стволовая клетка. В дальнейшем происходит развитие двух типов лимфоцитов: Т и В (тимусзависимых и бурсазависимых). Эти названия клетки получили в связи с их происхождением. Т-клетки развиваются в тимусе (зобной, или вилочковой железе) и под влиянием веществ, выделяемых тимусом, в периферической лимфоидной ткани.

Название В-лимфоциты (бурсазависимые) произошло от слова "бурса" - сумка. В сумке Фабрициуса у птиц развиваются клетки, сходные с В-лимфоцитами человека. Хотя у человека не найдено органа, аналогичного сумке Фабрициуса, название связано с этой сумкой.

При развитии В-лимфоцитов из стволовой клетки они проходят несколько стадий и преобразуются в лимфоциты, способные образовывать плазматические клетки. Плазматические клетки в свою очередь образуют антитела и на их поверхности имеются иммуноглобулины трех классов: IgG, IgM и IgA (рис. 32).

Иммунный ответе виде продукции специфических антител происходит следующим образом: чужеродный антиген, проникнув в организм, прежде всего фагоцитируется макрофагами. Макрофаги, перерабатывая и концентрируя антиген на своей поверхности, передают информацию о нем Т-клеткам, которые начинают делиться, "созревают" и выделяют гуморальный фактор, включающий в антителопродукцию В-лимфоциты. Последние также "созревают", развиваются в плазматические клетки, которые и синтезируют антитела заданной специфичности.

Так, соединенными усилиями макрофаги, Т- и В-лимфоциты осуществляют иммунные функции организма - защиту от всего генетически чужеродного, в том числе и от возбудителей инфекционных болезней. Защита с помощью антител осуществляется таким образом, что синтезированные к данному антигену иммуноглобулины, соединяясь с ним (антигеном), подготавливают его, делают чувствительным к разрушению, обезвреживанию различными естественными механизмами: фагоцитами, комплементом и пр.

Контрольные вопросы

1. Какова роль макрофагов в иммунном ответе?

2. Какова роль Т-лимфоцитов в иммунном ответе?

3. Какова роль В-лимфоцитов в иммунном ответе?

Теории иммунитета . Значение антител в развитии иммунитета неоспоримо. Каков же механизм их образования? Этот вопрос в течение длительного времени является предметом споров и обсуждений.

Создано несколько теорий антителообразования, которые можно разделить на две группы: селективные (селекция - отбор) и инструктивные (инструктировать - наставлять, направлять).

Селективные теории предполагают существование в организме уже готовых антител к каждому антигену или клеток, способных синтезировать эти антитела.

Так, Эрлих (1898) предполагал, что клетка имеет готовые "рецепторы" (антитела), которые соединяются с антигеном. После соединения с антигеном, антитела образуются еще в большем количестве.

Такого же мнения придерживались создатели других селективных теорий: Н. Ерне (1955) и Ф. Бернет (1957). Они утверждали, что уже в организме плода, а затем и во взрослом организме имеются клетки, способные к взаимодействию с любым антигеном, но под влиянием определенных антигенов определенные клетки вырабатывают "нужные" антитела.

Инструктивные теории [Гауровитц Ф., Полинг Л., Ландштейнер К., 1937-1940] рассматривают антиген, как "матрицу", штамп, на котором формируются специфические группировки молекулы антител.

Однако эти теории не объясняли всех явлений иммунитета и в настоящее время наиболее принятой является клонально-селекционная теория Ф. Бернета (1964). Согласно этой теории в эмбриональном периоде в организме плода имеется множество лимфоцитов - клеток-предшественников, которые при встрече с собственными антигенами разрушаются. Поэтому во взрослом организме уже нет клеток для выработки антител к собственным антигенам. Однако, когда взрослый организм встречается с чужеродным антигеном, происходит селекция (отбор) клона иммунологически активных клеток и они вырабатывают специфические антитела, направленные против данного "чужого" антигена. При повторной встрече с этим антигеном клеток "отобранного" клона уже больше и они быстрее образуют большее количество антител. Эта теория наиболее полно объясняет основные явления иммунитета.

Механизм взаимодействия антигена и антител имеет различные объяснения. Так, Эрлих уподоблял их соединение реакции между сильной кислотой и сильным основанием с образованием нового вещества типа соли.

Бордэ считал, что антиген и антитела взаимно адсорбируют друг друга подобно краске и фильтровальной бумаге или йоду и крахмалу. Однако эти теории не объясняли главного - специфичности иммунных реакций.

Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") (рис. 33). Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты. Согласно гипотизе Полинга (см. рис. 33) антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.

При оптимальном соотношении антигена и антител образуются большие прочные комплексы, видимые простым глазом. При избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы. При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

На основании изложенных теорий специфичность реакции антиген - антитело сегодня представляют как взаимодействие детерминантной группы антигена и активных центров антитела. Так как антитела формируются под воздействием антигена, их структура соответствует детерминантным группам антигена. Детерминантная группа антигена и фрагменты активных центров антитела имеют противоположные электрические заряды и, соединяясь, образуют комплекс, прочность которого зависит от соотношения компонентов и среды, в которой они взаимодействуют.

Учение об иммунитете - иммунология - достигло за последние десятилетия больших успехов. Раскрытие закономерностей иммунного процесса позволило решить различные задачи во многих областях медицины. Разработаны и совершенствуются методы предупреждения многих инфекционных заболеваний; лечения инфекционных и ряда других (аутоиммунных, иммунодефицитных) болезней; предупреждения гибели плода при резус-конфликтных ситуациях; трансплантации тканей и органов; борьбы со злокачественными новообразованиями; иммунодиагностики - использования реакций иммунитета в диагностических целях.

Реакции иммунитета - это реакции между антигеном и антителом или между антигеном и сенсибилизированными * лимфоцитами, которые происходят в живом организме и могут быть воспроизведены в лабораторных условиях.

* (Сенсибилизированные - повышенно чувствительные. )

Реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX - начале XX века. В силу высокой чувствительности (улавливают антигены в очень больших разведениях) и, главное, строгой специфичности (позволяют отличить близкие по составу антигены) они нашли широкое применение в решении теоретических и практических вопросов медицины и биологии. Этими реакциями пользуются иммунологи, микробиологи, инфекционисты, биохимики, генетики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи и врачи других специальностей.

Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum - сыворотка) или гуморальными (от лат. humor - жидкость), потому что участвующие в них антитела (иммуноглобулины) всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами называются клеточными.

Контрольные вопросы

1. Как образуются антитела?

2. Какие Вы знаете теории образования антител?

3. Каков механизм взаимодействия антигена с антителом?

Серологические реакции

Серологические реакции - реакции взаимодействия между антигеном и антителом протекают в две фазы: 1-я фаза - специфическая - образование комплекса антигена и соответствующего ему антитела (см. рис. 33). Видимого изменения в этой фазе не происходит, но образовавшийся комплекс становится чувствительным к неспецифическим факторам, находящимся в среде (электролиты, комплемент, фагоцит); 2-я фаза - неспецифическая. В этой фазе специфический комплекс антиген - антитело взаимодействует с неспецифическими факторами среды, в которой происходит реакция. Результат их взаимодействия может быть видим невооруженным глазом (склеивание, растворение и т. п.). Иногда эти видимые изменения отсутствуют.

Характер видимой фазы серологических реакций зависит от состояния антигена и условий среды, в которой происходит его взаимодействие с антителом. Различают реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента и др. (табл. 14).

Применение серологических реакций . Одно из основных применений серологических реакций - лабораторная диагностика инфекций. Их используют: 1) для выявления антител в сыворотке больного, т. е. для серодиагностики; 2) для определения вида или типа антигена, например выделенного от больного микроорганизма, т. е. для его идентификации.

При этом неизвестный компонент определяют по известному. Например, для обнаружения антител в сыворотке больного берут известную лабораторную культуру микроорганизма (антиген). Если сыворотка реагирует с ним, значит она содержит соответствующие антитела и можно думать, что данный микроб является возбудителем болезни у обследуемого больного.

Если нужно определить, какой микроорганизм выделен, его испытывают в реакции с известной диагностической (иммунной) сывороткой. Положительный результат реакции говорит о том, что данный микроорганизм идентичен тому, которым иммунизировали животное для получения сыворотки (табл. 15).

Серологические реакции применяют также для определения активности (титра) сывороток и в научных исследованиях.

Проведение серологических реакций требует особой подготовки.

Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой. Применяют пробирки (бактериологические, агглютинационные, преципитационные и центрифужные), пипетки градуированные разного размера и пастеровские * , колбы, цилиндры, предметные и покровные стекла, чашки Петри, пластины из пластмассы с лунками.

* (Каждый ингредиент реакции разливают отдельной пипеткой. Пипетки следует сохранять до конца постановки опыта. Для этого удобно помещать их в стерильные пробирки с пометками, где какая пипетка. )

Инструменты и оборудование: петля, штативы, лупа, агглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифуга, весы химические с разновесом.

Материалы: антитела (иммунные и исследуемые сыворотки), антигены (культуры микроорганизмов, диагностикумы, экстракты, лизаты, гаптены, эритроциты, токсины), комплемент, изотонический раствор натрия хлорида.

Внимание! В серологических реакциях применяют только химически чистый натрия хлорид.

Сыворотки . Сыворотка больного. Сыворотку обычно получают на второй неделе болезни, когда можно ожидать наличие в ней антител, иногда пользуются сыворотками реконвалесцентов (выздоравливающих) и переболевших.

Чаще всего для получения сыворотки кровь берут из вены в количестве 3-5 мл в стерильную пробирку и направляют в лабораторию, сопровождая этикеткой, с указанием фамилии и инициалов больного, предполагаемого диагноза и даты.

Кровь следует брать натощак или не раньше чем через 6 ч после еды. В сыворотке крови после еды могут содержаться капельки жира, которые делают ее мутной и непригодной для исследования (такая сыворотка называется хилезной).

Внимание! При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре или ставят в термостат при 37° С на 30 мин для образования сгустка.

Внимание! Не следует держать сыворотку в термостате больше 30 мин - может произойти гемолиз, что помешает проведению исследований.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или петлей ("обводят"). Пробирку помещают в холодильник на некоторое время (обычно 1 ч, но не более 48 ч) для лучшего отделения сыворотки из сжавшегося на холоде сгустка. Затем сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой, снабженной резиновым баллоном или шлангом.

Отсасывать сыворотку следует очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы. Сыворотка должна быть совершенно прозрачной без примеси клеток. Мутные сыворотки еще раз отсасывают после того, как клетки осядут. Сыворотку можно освободить от форменных элементов центрифугированием.

Внимание! На сгустке сыворотка может оставаться не более 48 ч при + 4° С.

Для получения сыворотки кровь можно брать из прокола мякоти пальца или мочки уха пастеровской пипеткой. У грудных детей кровь берут из У-образного разреза на пятке.

При использовании пастеровской пипетки кровь насасывают в пипетку из прокола. Острый конец пипетки запаивают. Пипетку помещают в пробирку острым концом вниз. Чтобы он не сломался, на дно пробирки кладут кусочек ваты. Пробирку с соответствующей этикеткой направляют в лабораторию. Скопившуюся в широком конце пипетки сыворотку отсасывают.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном (вакциной). В полученной сыворотке определяют ее активность (титр), т. е. наибольшее разведение, в котором она реагирует с соответствующим антигеном в определенных условиях опыта.

Готовят сыворотки обычно на производстве. Их разливают в ампулы, на которых указывают название и титр. В большинстве случаев сыворотки высушивают. Сухую сыворотку перед употреблением растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема (тоже указан на этикетке). Хранят все сухие (лиофилизированные) диагностические" препараты при 4-10° С.

Для серологических исследований применяют иммунные сыворотки нативные (не адсорбированные) и адсорбированные. Недостаток нативных сывороток - наличие в них групповых антител, т. е. антител к микроорганизмам, имеющим общие антигены. Обычно такие антигены встречаются у микробов, принадлежащих к одной группе, роду, семейству. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью: реагируют только с гомологичным антигеном. Антитела к другим (гетерогенным) антигенам удалены адсорбцией. Титр антител адсорбированных сывороток низкий (1:40, 1:320), поэтому их не разводят * .

* (В настоящее время методом биотехнологии получены особые клетки (гибридомы), вырабатывающие in vitro моноклональные антитела, т. е. антитела, реагирующие строго специфично (с одним антигеном). )

Реакция агглютинации

Реакция агглютинация (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом. Для реакции необходимы:

1. Антитела (агглютинины) - находятся в сыворотке больного или в иммунной сыворотке.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический раствор.

Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб.

При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при диагностике кишечных инфекций, коклюша и др.

Подготовка ингредиентов: 1) получение сыворотки см. с. 200; 2) приготовление антигена. Взвесь живых микробов должна быть гомогенной и соответствовать (в 1 мл) примерно 30 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК. Для ее приготовления обычно используют 24-часовую культуру, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3-4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют ее густоту и, если нужно, разводят.

Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу и делает ее безопасной. Обычно пользуются диагностикумами, приготовленными на производстве.

Постановка реакции. Существует два метода проведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда ее называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках).

Реакция агглютинации на стекле . На обезжиренное предметное стекло наносят 2 капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:25. Капли на стекло наносят так, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Культуру петлей или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического раствора и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора, которая является контролем антигена.

Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, а в контроле антигена должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешана с сывороткой, появятся хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считают положительным. При отрицательном результате реакции в капле будет равномерная муть, как в контроле антигена.

Реакция отчетливее видна, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем свете. При ее изучении можно пользоваться лупой.

Развернутая реакция агглютинации . Готовят последовательные, чаще всего двукратные разведения сыворотки. Сыворотку больного обычно разводят от 1:50 до 1:1600, иммунную - до титра или до половины титра. Титр агглютинирующей сыворотки - ее максимальное разведение, в котором она агглютинирует гомологичные клетки.

Разведение сыворотки: 1) ставят в штатив нужное количество пробирок одинакового диаметра, высоты и конфигурации дна;

2) на каждой пробирке указывают степень разведения сыворотки, кроме того, на 1-й пробирке пишут номер опыта или название антигена. На пробирках контролей пишут "КС" - контроль сыворотки и "КА" - контроль антигена;

3) во все пробирки наливают по 1 мл изотонического раствора;

4) в отдельной пробирке готовят исходное (рабочее) разведение сыворотки. Например, для приготовления рабочего разведения 1:50, в пробирку наливают 4,9 мл изотонического раствора и 0,1 мл сыворотки. На пробирке обязательно указывают степень ее разведения. Исходное разведение сыворотки вносят в первые две пробирки и в пробирку контроля сыворотки;

5) готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

Примерная схема ее разведения приведена в табл. 16.

Примечание. Стрелки указывают перенос жидкости из пробирки в пробирку; из 5-й пробирки и пробирки контроля сыворотки 1,0 мл выливают в дезинфицирующий раствор.

Внимание! Во всех пробирках должен быть одинаковый объем жидкости.

После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносят по 1-2 капли антигена (диагностикума или свежеприготовленной взвеси бактерий). В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная муть. Контроль сыворотки остается прозрачным.

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37° С). Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный - спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре).

Учет результатов как всегда начинают с контролей. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, контроль антигена - равномерно мутным. Просматривают пробирки в проходящем свете (очень удобно на темном фоне) невооруженным глазом, с помощью лупы или агглютиноскопа.

Агглютиноскоп - прибор, состоящий из полой металлической трубки, укрепленной на подставке. Сверху на ней расположен окуляр с регулирующим винтом. Под трубкой прикреплено вращающееся зеркало. Пробирку с изучаемой жидкостью вставляют сбоку в отверстие трубки на такое расстояние, чтобы находящаяся в ней жидкость была под окуляром. Установив с помощью зеркала освещение и сфокусировав окуляр, определяют наличие и характер агглютината.

При положительном результате реакции в пробирках видны зерна или хлопья агглютината. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде "зонтика", а жидкость над осадком просветляется (сравните с равномерно мутным контролем антигена).

Для изучения величины и характера осадка содержимое пробирок слегка встряхивают. Различают мелкозернистую и хлопьевидную агглютинацию. Мелкозернистая (О-агглютинация) получается при работе с О-сыворотками * . Хлопьевидная (Н) - при взаимодействии подвижных микроорганизмов со жгутиковыми Н-сыворотками.

* (О-сыворотки содержат антитела к О (соматическому)-антигену, Н-сыворотки - к жгутиковому. )

Хлопьевидная агглютинация наступает быстрее, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный.

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный.

Осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакции слабо положительный.

Незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции.

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции.

Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации . 1. Спонтанная (самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-форме, не дают однородной (гомогенной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не дает спонтанной агглютинации.

2. В сыворотке здоровых людей имеются антитела к некоторым микроорганизмам (так называемые "нормальные антитела"). Титр их невысок. Поэтому положительный результат реакции в разведении 1:100 и выше говорит о ее специфичности.

3. Групповая реакция с близкими по антигенному строению микробами. Например, сыворотка больного брюшным тифом может также агглютинировать бактерии паратифа А и Б. В отличие от специфической групповая реакция идет в более низких титрах. Адсорбированные сыворотки не дают групповой реакции.

4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесенной болезни и даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются "анамнестическими". Чтобы отличить их от "инфекционных" антител, образующихся в течение текущей болезни, реакцию ставят в динамике, т. е. исследуют сыворотку больного, взятую повторно через 5-7 дней. Повышение титра антител говорит о наличии болезни - титр "анамнестических" антител не повышается, а может даже снизиться.

Контрольные вопросы

1. Что такое реакции иммунитета, каковы их основные свойства?

2. Какие компоненты участвуют в серологических реакциях? Почему реакции называют серологическими, из скольких фаз они состоят?

3. Что такое реакция агглютинации? Ее использование и методы проведения. Что такое диагностикум?

4. Каким антигеном пользуются при исследовании сыворотки больного? Какой сывороткой определяют вид неизвестного микроба?

5. Что такое О- и Н-агглютинация? В каких случаях образуется хлопьевидный осадок и когда мелкозернистый?

Задание

1. Поставьте развернутую реакцию агглютинации для определения титра антител в сыворотке больного и учтите ее результат.

2. Поставьте реакцию агглютинации на стекле для определения вида выделенного микроорганизма.

Реакция гемагглютинации

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации (РГА).

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита - эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Постановка реакции. Реакцию ставят в пробирках или на специальных пластинах с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объемом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят в термостат на 30 мин, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 мин.

Учет результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями ("зонтик"), покрывающий все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями ("пуговку"). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками "плюс". Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Высокая специфичность реакции торможения гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных двукратных разведениях от 1:10 до 1:2560 смешивают с равным объемом материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра, установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин, после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.

Реакцию сопровождают тремя контролями (табл. 17).

Учет результатов производят после повторной инкубации в термостате в течение 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться "пуговка" - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется "зонтик" - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется "пуговка" - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки - это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

Контрольные вопросы

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

Задание

Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.

Реакция преципитации

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК (рис. 35).

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента: 1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; взвесь микроорганизмов Основная 2. Антитело - сыворотка больного система 3. Комплемент - сыворотка морских свинок 4. Антиген - эритроциты барана Гемолити- 5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана ческая 6. Изотонический раствор система

Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложных компонентов, они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно весь опыт проводят в объемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Подготовка ингредиентов

1. Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта; объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте * .

* (Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. )

2. Эритроциты барана . Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте.

Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С (сенсибилизируют).

3. Комплемент обычно разводят 1:10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37° С. Схема титрования комплемента представлена в табл. 21.

Примечание. Общий объем жидкости в пробирках 2,5 мл.

Внимание! Титруют комплемент в таком же объеме, в каком ставят основной опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50 пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 мл × 50) и 15 мл изотонического раствора (0,3 мл × 50).

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т. е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в разведении от 1:10 до 1:160.

Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.

Внимание! Все компоненты готовят с небольшим избытком.

Проведение основного опыта

При постановке опыта крайне важна последовательность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы (табл. 22).

1 (В опыте сыворотку можно изучать в последовательных двукратных разведениях. )

Фаза I . В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С 45 мин - 1 ч или при 4° С ("РСК на холоде") 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции "на холоде" значительно повышает ее чувствительность и специфичность.

Фаза II . По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.

Учет результатов. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, следует немедленно вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.

Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.

В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.

Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.

Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае будет гемолиз.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

Полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;

Лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;

Лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;

Лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;

Лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.

Контрольные вопросы

1. В чем состоит принцип РСК?

2. Какие системы участвуют в РСК? Из чего состоит и какую роль в реакции выполняет гемолитическая система?

3. В чем состоит подготовка к основному опыту РСК? В какой последовательности его проводят? Сколько фаз в РСК?

4. О чем говорит отсутствие гемолиза в РСК?

Задание

1. Проведите титрование комплемента и установите его рабочую дозу.

2. Произведите расчет всех ингредиентов для постановки основного опыта, проведите опыт, учтите и зарисуйте результат.

Peaкция иммунофлюоресценции

В реакции иммунофлюоресценции (РИФ) используют люминесцентную микроскопию (см. главу 2) для серологических исследований. Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Такие сыворотки называются люминесцирующими * . Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры (можно обнаружить микроорганизмы непосредственно в материале от больного: кале при холере, мокроте при коклюше, мозговой ткани при бешенстве). Результат можно получить через полчаса после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки. Поэтому РИФ широко применяют при экспресс (ускоренной)-диагностике ряда инфекций.

* (Флюрохромы: флюоресцеин дает зеленое свечение, родамин - красное. )

Для приготовления препаратов предметное стекло с фиксированным мазком (отпечатком, срезом) помещают во влажную камеру. Камеру готовят следующим образом. На дно чашки Петри кладут влажную фильтровальную бумагу. На нее параллельно укладывают две стеклянные палочки (можно использовать широкую часть пастеровских пипеток). На них мазком вверх помещают предметное стекло.

Внимание! Не забудьте мазок с обратной стороны обвести восковым карандашом.

На мазок наносят каплю люминесцирующей сыворотки. Закрывают чашку и помещают в термостат или оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин. После инкубации промывают забуференным изотоническим раствором (рН 7,4), ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм!) и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы, гомологичные антителам люминесцирующей сыворотки, они ярко светятся на темном фоне. Этот метод называется прямой (рис. 36). Неудобство прямого метода РИФ состоит в том, что для его постановки необходимы люминесцирующие сыворотки к каждому определяемому антигену, готовить которые сложно, а полного набора готовых люминесцирующих сывороток к любому антигену нет. Поэтому пользуются часто непрямым методом. Он заключается в том, что на первом этапе препарат обрабатывают нелюминесцирующей иммунной специфической сывороткой к искомому антигену. В случае, если в препарате имеются искомые антигены (микробы), то образуется комплекс антиген - антитело, который увидеть нельзя. После высушивания, на втором этапе препарат обрабатывают люминесцирующей сывороткой, содержащей антитела не к искомому антигену, а к глобулинам того вида животного, от которого получена специфическая сыворотка. Например, если первая сыворотка получена при иммунизации кролика, то вторая должна содержать антитела к кроличьим глобулинам (см. рис. 36). Эти антитела соединяются с глобулинами специфической сыворотки, которые адсорбировались на искомом антигене, и комплекс светится при рассматривании препарата в люминесцентный микроскоп.

Опсонофагоцитарная реакция

Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) является одним из методов оценки активности иммунного фагоцитоза. Чем эта активность выше, тем выше устойчивость организма к инфекции. В иммунном организме под влиянием антител (опсонинов) фагоцитоз протекает активнее (поглощается большее количество микробов в более короткий срок). Поэтому показатели фагоцитарной активности имеют не только диагностическое значение (например, при бруцеллезе), но и позволяют прогнозировать исход инфекционного процесса, оценивать результаты лечения и вакцинации. Для реакции необходимы:

1. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов.

2. Антитело (опсонины) - исследуемая сыворотка.

3. Фагоциты - обычно нейтрофилы исследуемой крови.

Постановка реакции. С помощью микропипетки в небольшие пробирки наливают 0,05 мл 2% раствора натрия цитрата; 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 мл взвеси микроорганизмов, густота которой соответствует в 1 мл 10 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК.

Внимание! Для каждого ингредиента должна быть использована отдельная пипетка.

Содержимое пробирок перемешивают. Пробирки ставят в термостат на 30 мин, после чего вновь перемешивают их содержимое и готовят тонкие мазки (как мазки крови). Окрашивают по Романовскому - Гимзе.

Учет результатов. В разных местах мазка подсчитывают 25 нейтрофилов, учитывая в каждом из них количество захваченных микроорганизмов. Показатель опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по формуле:

ПОФР = 3а + 2б + 1с + 0,

где а - число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии; б - число нейтрофилов, содержащих от 21 до 40 бактерий; с - число нейтрофилов, содержащих от 1 до 20 бактерий; 0 - число нейтрофилов, не содержащих бактерии.

Максимальный показатель опсонофагоцитарной реакции при такой системе учета составляет 75.

Результат реакции оценивают по следующей схеме:

при ПОФР от 1 до 24 - слабоположительный;

при ПОФР от 25 до 49 - ясновыраженный;

при ПОФР от 50 до 75 - резкоположительный.

У здоровых людей ПОФР составляет 0-1, редко 4-5. Ясновыраженный и резкоположительный результаты реакции говорят о высоком опсонизирующем действии сыворотки обследуемого лица с выраженной активностью фагоцитов крови.

Определение только активности антител - опсонинов проводится опытом установления опсоиического индекса - отношения фагоцитарного показателя в присутствии иммунной (исследуемой) сыворотки к фагоцитарному показателю в сыворотке, заведомо не содержащей антител к данному микробу. Опыт ставят так: берут 2 пробирки, в одну из которых (опытную) вносят в равных количествах (обычно по 0,2 мл): 1) сыворотку обследуемого лица; 2) взвесь микробов, в котором определяют наличие опсонинов; 3) лейкоциты (можно из брюшной полости мыши). В контрольную пробирку вносят: 1) сыворотку без опсонинов (контрольную); 2) те же микробы, что и в опытную; 3) лейкоциты (те же, что и в опытную пробирку).

Обе пробирки выдерживают в термостате в течение 30 мин, а затем из той и другой готовят мазки, фиксируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе. Микроскопируют мазки и определяют фагоцитарный показатель в опытной и контрольной пробирках.

При наличии опсонинов в исследуемой сыворотке опсонический индекс будет больше единицы. Чем больше число, полученное от деления показателя фагоцитоза исследуемой на фагоцитарный показатель контрольной сыворотки, тем более выражено действие антител - опсонинов.

Контрольные вопросы

1. На каком свойстве антител основана ОФР? Специфична ли эта реакция?

2. О чем свидетельствует показатель ОФР, равный 75?

Задание

Исследуйте ОФР крови, взятой из пальца. Зарисуйте фагоциты. Вычислите ПОРФ.

Реакции иммунитета in vivo (кожаные пробы)

При нанесении антигена на скарифицированную кожу или введении внутрикожно можно выявить как иммунное состояние, так и состояние повышенной чувствительности к данному препарату.

Кожная проба с токсином . Внутрикожно вводят оттитрованное количество токсина. Если организм иммунен, т. е. обладает определенным уровнем антитоксина, действие токсина не проявится - произойдет нейтрализация токсина антитоксином. В неиммунном организме на месте введения токсина разовьется воспалительный инфильтрат (краснота, уплотнение и т. д.).

Кожные пробы с аллергеном (кожно-аллергические пробы) для изучения реакций повышенного типа (см. главу 13). При повышенной чувствительности немедленного типа введенный аллерген (антиген) вступает в реакцию с антителами, адсорбированными на клетках различных органов. Повышенная чувствительность замедленного типа обусловлена реакцией на аллерген сенсибилизированных Т-лимфоцитов. Такая сенсибилизация бывает при ряде инфекций у больных, переболевших и привитых (туберкулез, бруцеллез и др.). Поэтому кожно-аллергические пробы при этих инфекциях имеют диагностическое значение.

Препараты для кожных проб готовят специальные производства, снабжая инструкцией по их применению.

Контрольные вопросы

1. Что является антителом в кожной пробе с токсином? О чем свидетельствует отрицательный результат этой пробы?

2. Какая реакция позволяет выявить состояние повышенной чувствительности организма к инфекционному агенту?

Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных болезней

Попытки предупредить тяжелое течение смертельно опасной болезни, вызвав легкую форму заболевания, делались на протяжении столетий в разных странах мира.

Научное обоснование и практическое внедрение иммунопрофилактики впервые дал Л. Пастер, который создал принципы применения ослабленных (аттенуированных) микроорганизмов и приготовил препараты (вакцины) для предупреждения некоторых инфекционных заболеваний человека и животных.

Прошло более ста лет и в настоящее время искусственное создание иммунитета - основа борьбы с инфекционными заболеваниями.

Иммунизация - введение препаратов для создания искусственного активного иммунитета - проводится в определенные годы на протяжении всей жизни человека. В первые же дни после рождения ребенок получает вакцину БЦЖ против туберкулеза. На 1-м году жизни ему делают прививки, чтобы предупредить заболевания дифтерией, коклюшем и столбняком, вакцинируют против полиомиелита, кори и пр. Таким образом проводят специфическую профилактику инфекционных болезней, для которой используют вакцины.

Вакцины - препараты для активной иммунизации могут быть:

1. Корпускулярные (из микробных клеток) - живые и убитые.

2. Химические (антигены и антигенные фракции).

3. Анатоксины.

Живые аттенуированные вакцины готовят из живых микроорганизмов, вирулентность которых ослаблена (от лат. attenuer - ослаблять, смягчать), а иммуногенные свойства (способность вызывать невосприимчивость) сохранены.

Для получения таких микроорганизмов существуют разные способы:

1) выращивание на питательных средах, неблагоприятных для роста и размножения возбудителя; при действии физических и химических факторов (так была получена вакцина БЦЖ для профилактики туберкулеза); 2) пассирование возбудителя через организм животного, мало восприимчивого к воспроизводимой инфекции (так Л. Пастер получил вакцину против бешенства); 3) отбор естественных культур микроорганизмов, маловирулентных для человека (так получена вакцина против чумы) и др.

Живые вакцины создают напряженный иммунитет, так как вызывают процесс, сходный с естественным инфекционным, только слабо выраженный, почти без клинических проявлений. При этом приводится в действие весь механизм иммуногенеза - создается невосприимчивость.

Убитые вакцины - культуры микроорганизмов, инактивированные действием высокой температуры, химических веществ (фенол, формалин, спирт, ацетон), УФ-лучей и др. При этом подбирают такие факторы воздействия, которые полностью сохраняют иммуногенные свойства микробных клеток.

Химические вакцины - отдельные компоненты микробной клетки (антигены), полученные путем специальной обработки микробной взвеси.

Химические вакцины обычно быстро всасываются после введения в организм, что не позволяет достичь нужного иммуногенного раздражения, поэтому к вакцинам добавляют вещества, удлиняющие время всасывания: гидроксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, минеральные масла и др. Это называют созданием "депо".

Химические вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, менингита и др.

Анатоксины (от лат. ana - обратно) - это экзотоксины бактерий, обезвреженные воздействием формалина (0,3-0,4%) и выдерживанием при температуре 37° С в течение 3-4 нед. При этом происходит потеря токсических свойств, но сохранение иммуногенных.

В настоящее время получены и применяются анатоксины из токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др.

Анатоксины очищают от примесей питательных сред (балластные белки) и сорбируют на веществах, которые всасываются медленно из места введения.

По количеству антигенов, входящих в состав вакцины, различают: моновакцины (из одного вида антигенов), дивакцины (из двух антигенов), три вакцины (из трех антигенов) и т. д.

Ассоциированные вакцины готовят из антигенов различных бактерий и анатоксинов. Например, ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит убитые коклюшные микробы и анатоксины: дифтерийный и столбнячный.

Вакцины вводят внутримышечно, подкожно, накожно, внутрикожно, через рот. Иммунизируют либо однократно, либо двукратно и трехкратно с интервалами в 1-2 нед и больше. Кратность введения, интервалы между вакцинациями зависят от характера вакцины - для каждой разработаны схемы введения.

После введения вакцины могут возникнуть общие и местные реакции. К общим относятся повышение температуры (до 39° С), головная боль, недомогание. Эти явления обычно проходят через 2-3 дня. Местные реакции - краснота и инфильтрат на месте введения вакцины могут появиться через 1-2 дня после прививки. При накожном введении вакцины (против туляремии, БЦЖ и др.) появление местной реакции свидетельствует об эффективности прививки.

Существуют противопоказания для вакцинации: лихорадочное состояние, острые инфекционные заболевания, аллергия и др. Не прививают также женщин во второй половине беременности.

Вакцины и анатоксины готовят на предприятиях по производству бактерийных препаратов. Для их изготовления необходимы большие количества микробной взвеси (биомасса) или материала, содержащего вирусы.

Готовые препараты разливают в ампулы или флаконы и большей частью высушивают. Сухие препараты дольше сохраняют активность и другие свойства.

Некоторые вакцины, например полиомиелита, выпускают в виде таблеток или драже.

На каждую ампулу, флакон и коробку с препаратами наклеивают этикетки с указанием названия препарата, его объема, срока годности, номера серии и контрольного номера.

В каждую коробку кладут наставление по применению.

Хранят препараты в основном при температуре 4° С. Нельзя подвергать препараты замораживанию и оттаиванию, действию высокой температуры. При транспортировке соблюдают особые условия. Нельзя применять препараты, которые имеют трещины на ампулах и измененный внешний вид.

В СССР существует система Государственного контроля за качеством медицинских иммунобиологических препаратов, которая обеспечивает их эффективность и стандартность.

Особый вид вакцин - а у то вакцины. Их готовят в бактериологических лабораториях из микробов, выделенных от больного. Применяют аутовакцину для лечения только данного больного. Чаще всего используют аутовакцины для лечения хронически протекающих инфекций (стафилококковых и др.). Вводят аутовакцину многократно, малыми дозами по разработанной для каждой вакцины схеме. Аутовакцины стимулируют защитные силы организма, чем способствуют выздоровлению.

Сывороточные препараты применяют для создания искусственного пассивного иммунитета. К ним относят специфические иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Эти препараты содержат готовые антитела. Их получают из крови доноров - специально проиммунизированных людей или животных (против кори, гриппа, столбняка). Кроме того, используют сыворотку переболевших и даже здоровых людей, если в ней содержится достаточное количество антител. В качестве сырья для приготовления иммунных препаратов используют также плацентарную и абортную кровь.

Имеются антибактериальные и антитоксические сыворотки. Первые имеют более ограниченное применение. Антитоксические сыворотки применяют для лечения дифтерии, столбняка, ботулизма и др. Эти сыворотки выпускают с определенным содержанием антитоксина, которое измеряют в международных единицах (ME).

Иммунные сывороточные препараты получают из крови животных, главным образом лошадей, многократно иммунизированных. По окончании иммунизации определяют уровень антител в крови и делают кровопускание. Полученную сыворотку консервируют, контролируют ее стерильность, активность и физические свойства.

Препараты, полученные из крови лошадей, содержат чужеродные для человека белки, которые при повторном введении могут вызвать аллергические реакции: сывороточную болезнь и анафилактический шок. Для предупреждения осложнений сывороточные препараты следует вводить с предосторожностями (по Безредке) (см. главу 13). Для освобождения сывороток животных от балластных белков и концентрации антител применяют различные методы, основным из которых является метод "Диаферм-3", разработанный в нашей стране и включающий ферментативный гидролиз балластных белков.

Кроме того, для концентрации антител в меньшем объеме препарата разработаны методы выделения из сыворотки крови гамма-глобулинов, содержащих антитела. Такие препараты называют иммуноглобулинами. Их готовят из сыворотки человека (гомологичные) и животных (гетерологичные).

Эффективность иммуноглобулинов гораздо выше эффективности иммунных сывороток, а осложнений наблюдается несоизмеримо меньше. В настоящее время иммуноглобулины применяют гораздо более широко, чем сыворотки.

В нашей стране иммуноглобулины используют для профилактики кори, гепатита, краснухи и др. Профилактическое введение иммуноглобулинов проводят при подозрении на заражение или при заражении. Целесообразно вводить эти препараты в первые дни после заражения (начало инкубационного периода), пока патологический процесс еще не развился.

При лечебном применении препарата раннее его введение дает больший эффект.

Сыворотки и иммуноглобулины вводят внутримышечно и внутривенно.

Своевременное и правильное использование сывороточных препаратов позволяет снизить заболеваемость многими инфекциями.

Контрольные вопросы

1. Какие виды вакцин Вы знаете?

2. Какими препаратами создают пассивный иммунитет?

3. Что такое аутовакцина?

Иммунодиагностика

Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.

Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.

Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.

Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.

Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.

К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.

Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

протекающие in vivo . воспроизводимые in vitro

(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)

гуморальные клеточные серологические клеточные

В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).

Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .

Таблица № 15.

Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro

Феномены иммунодиагностических реакций
Агглютинации	Потребления комплемента	Иммунофлюо-ресценции	Преципитации	Нейтрализации	Иммуноконъю- гации
группы иммунодиагностических реакций
а. прямые б. непрямые в.торможения г. сорбции	б. непрямые в. торможения	б.непрямые в.торможения	а. осадочные б. диффузионные	а. гашения действия б.нейтрализа-ции	а. прямые б.непрямые в. торможение

Иммунологические феномены

Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.

К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.

К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.

К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.

К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).

Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента

К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).

К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).

К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).

К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).

Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.

К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.

К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).

К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.

Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.

Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.

Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.

По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.

К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.

К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.

В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).

Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

Исследуемая культура.

Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА .

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновые антительные антигенные

белковые небелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап . Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап . Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
Исследуемая сыворотка, 1:50
Растворитель
Полученные разведения
АЭД, 5 % взвесь
Результат РНГА
Титр РНГА	Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли: первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап . Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап . Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап . Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
Известная сыворотка 1:100
Растворитель
Полученные разведения
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки	Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600): 3 = 1:533 .