Détermination des indications pour les études bactériologiques, virologiques et sérologiques lors de la décrétation de l'étiologie des OCI et de l'évaluation des résultats. Virologie de la recherche virologique Quelles sont les infections étudiées
La recherche virologique comprend deux étapes principales: la sélection des virus et leur identification. Le matériel de recherche virologique peut être du sang, d'autres fluides biologiques et pathologiques, biopsie des organes et des tissus.
La recherche virologique du sang est souvent effectuée afin de diagnostiquer ARBO infections virales. Dans la salive, la rage, la vapotite épidémique, la simplicité, les palmes nasophanes servent à mettre en évidence la grippe et les autres Arvi, la rougeole, peut être trouvée dans la salive. Dans les lavages avec les adénovirus de la conjonctive. Parmi les matières fécales, divers Entres, ADSNO, RSO, Nora et les rotavirus sont distingués.
Les cultures cellulaires, les embryons de poulet, parfois des animaux de laboratoire sont utilisés pour libérer des virus.
La plupart des virus pathogènes distinguent la présence de tissu et de spécificité typique, par exemple, le polyovirus n'est reproduit que dans des primates, il est donc utilisé pour mettre en évidence un certain virus, une culture tissulaire appropriée est utilisée. Pour mettre en évidence un agent pathogène inconnu, il est conseillé de simultané 3-4 cultures cellulaires, en supposant que l'un d'entre eux puisse être sensible. La présence d'un virus chez les cultures cellulaires infectées est déterminée par le développement de la dégénérescence cellulaire spécifique, c'est-à-dire Cytopathogène Dans l'action, détection d'inclusions intracellulaires, ainsi que sur la base de la détection d'un antigène spécifique par la méthode d'immunofluorescence, des réactions positives d'hémadsorption et d'hémagglutination.
Les embryons d'oiseaux avec leurs tissus inoccupés conviennent à la culture de nombreux virus. Le chat est utilisé par les embryons de poulet. Lors de la reproduction à l'embryon, les virus peuvent causer leur mort (arbovirus), l'apparition des changements dans la coque de chorion-allance (virus absolus) ou dans le corps de l'embryon, l'accumulation dans les fluides embryonnaires de la chuncture magique dans (virus de la grippe , vapotite) et le complément de l'antigène viral de remplissage.
L'identification des virus est effectuée en utilisant des méthodes immunologiques: la réaction de freinage de l'hémagglutination, la liaison complète, la neutralisation, les précipitations en gel, l'immunofluorescence.
Plus sur le sujet de la méthode virologique:
- Évaluation des principales données anthropométriques par une méthode paramétrique (méthode Sigmal)
- Traitement sur la méthode de défaillance défectueuse et de méthode de formation forcée
- 2. Méthode juridique comparative - Méthode scientifique privée de sciences juridiques
- Méthodes de diagnostic modernes et le choix de la méthode de traitement de la MISA utérin sous-muqueuse
- 5.4. Le concept et la structure de la méthode générale d'enquête sur la méthode d'activité pratique
- Sujet 8. Méthodes microbiologiques d'étude et de mécanismes pour informations transmises. Méthodes applicables pour créer de nouvelles têtes
- Sujet 15. La pathogénicité et la virulence des micro-organismes. Facteurs de virulence. Méthodes d'infection d'animaux de laboratoire. Antigènes, méthodes de préparation. Anticorps. Réactions d'immunité et leur utilisation pratique. Phagocytose
Méthodes de recherche virologique
méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. La virologie est largement utilisée des méthodes de biologie moléculaire, à l'aide de laquelle la structure moléculaire des particules virales a réussi à établir la structure moléculaire, les procédés de les pénétrer dans la cellule et les particularités de la reproduction des virus, la structure primaire des acides nucléiques viraux et des protéines. Les méthodes de détermination de la séquence d'éléments de composants d'acides nucléiques viraux et d'acides aminés de protéines sont en développement. Il est possible de relier les fonctions des acides nucléiques et des protéines codées par la séquence nucléotidique et établir les causes des processus intracellulaires jouant rôle important Dans la pathogenèse d'infection virale.
Les méthodes de recherche virtuologiques sont également basées sur des processus immunologiques (interaction de l'antigène avec des anticorps), propriétés biologiquesaH Virus (capacité d'hémagglutination, hémolyse, activité enzymatique), caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (la nature de l'effet cytopathique, la formation d'inclusions intracellulaires, etc.).
Dans le diagnostic d'infections virales, avec une culture, une isolation et une identification des virus, et le procédé de culture des tissus et des cellules est largement utilisé. Utilisation de cultures de cellules traduites et diploïdes primaires, secondaires, stables et diploïdes. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant des tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (plus souvent que les embryons des animaux. La suspension des cellules dans le milieu nutritif est placée dans les dossiers de matelas, de bouteilles ou de boîtes de Pétri, où, après la fixation de la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection, les virus utilisent généralement des monocouches cellulaires. Le fluide nutritif est versé, une suspension virale est introduite dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais est ajouté, généralement sans sérum.
Les cellules de la majorité des cultures primaires peuvent être placées, une telle culture s'appelle secondaire. Dans l'autre passage de cellules, la population de cellules semblables à la fibroblaste capables de reproduction rapide est formée, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont les soi-disant cellules diploïdes. Avec la culture en série de cellules, des cultures de cellules stables sont obtenues. Les passages apparaissent des cellules homogènes rapidement divisées avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes. Les lignes cellulaires stables peuvent être une couche simple et une suspension. Les cultures monocouche se développent sous la forme d'une couche solide sur la surface du verre, suspension - en tant que suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs d'agitation. Il y a plus de 400 lignées cellulaires obtenues à partir de 40 différentes espèces animaux (y compris les primates, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens, les poissons, les insectes) et l'homme.
Dans les milieux nutritifs artificiels, il est possible de cultiver des morceaux d'organes et de tissus individuels (cultures d'organes). Ces types de cultures conservent la structure du tissu, qui est particulièrement importante pour l'allocation et le passage des virus qui ne sont pas reproduits dans des cultures tissulaires indifférenciées (par exemple, coronavirus).
En infecté cultures cellulaires Les virus peuvent être détectés en modifiant la morphologie des cellules, l'effet cytopathique, qui peut avoir une nature spécifique, l'apparence d'inclusions, en déterminant des antigènes viraux dans la cellule et dans le fluide de culture; établir les propriétés biologiques de la progéniture virale dans le fluide culturel et la titrage des virus dans la culture des tissus, des embryons de poulet ou des animaux sensibles; En identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans les cellules par hybridation moléculaire ou grappes d'acides nucléiques par procédé cytochmique à l'aide de la microscopie fluorescente.
La sélection des virus est un processus fastidieux et long terme. Il est effectué afin de déterminer la circulation entre la population du type ou de la variante du virus (par exemple, d'identifier le virus de la grippe, la souche sauvage ou du vaccin du virus de la polio, etc.); Dans les cas où il est nécessaire pour les mesures épidémiologiques urgentes; Lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent; Si nécessaire, confirmez le diagnostic préliminaire; Pour indiquer des virus dans des objets ambiant. Lorsque le virus isolé, ils tiennent compte de la possibilité de les persister dans le corps humain, ainsi que de la survenue d'une infection mixte causée par deux virus et plus de virus. Une population de virus génétiquement homogène obtenue d'un virion est appelée clone virale et le processus d'obtention est le clonage.
Pour la sélection de virus, une infection d'animaux de laboratoire sensibles, des embryons de poulet, sont utilisés, mais la culture tissulaire est la plus souvent utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symbolastes et de sympithies, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par les méthodes d'immunofluorescence, hémadémie, hémagglutination (dans les virus d'hémagglutinisation ), etc. Ces signes ne peuvent être détectés qu'après 2-3 passages du virus.
Pour mettre en évidence un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, l'utilisation des embryons de poulet, pour mettre en évidence certains virus de COKES et un certain nombre d'arbovirus - souris nouveau-nés. L'identification des virus sélectionnés est effectuée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.
Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans la culture tissulaire, déterminant la plus grande dilution du fluide contenant du virus, dans laquelle la dégénérescence des tissus se produit et des antigènes spécifiques à virus sont formés. Pour titrer un certain nombre de virus, vous pouvez utiliser la méthode des plaques. Les plaques, ou les colonies négatives de virus sont des foyers détruits par le virus des cellules d'une culture de tissu unique sous un revêtement d'agar. Compter les colonies vous permet de dépenser analyse quantitative L'activité infectieuse des virus au taux du calcul est qu'une seule particule infectieuse du virus forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants de plomberie, généralement neutres; Les plaques n'adsorbent pas le colorant et donc visibles comme des taches légères sur le fond des cellules vivantes peintes. Le titre du virus est exprimé par le nombre d'unités de blanchiment dans 1 ml.
La purification et la concentration de virus sont généralement effectuées par ultracentrifugation différentielle, suivie d'une centrifugation dans des gradients de concentration ou de la densité. Les méthodes immunologiques, la chromatographie d'échange d'ions, les immunosorbants, etc. sont utilisées pour nettoyer les virus.
Les diagnostics de laboratoire d'infections virales incluent la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériau clinique; sélection du virus de ce matériau; Sérodiagnostique. Choisir une méthode diagnostic de laboratoire Dans chaque cas, cela dépend de la nature de la maladie, de la période de maladie et des possibilités du laboratoire. Diagnostic moderne Les infections virales sont basées sur des méthodes rapides, permettant de recevoir une réponse quelques heures après avoir pris des matériaux cliniques au début de la maladie, il comprend une microscopie électronique et une microscopie électronique immunitaire, une méthode d'hybridation moléculaire, détectant des anticorps de classe LGM et autres.
La microscopie électronique des virus peints par une contraste négative vous permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic d'infections virales est limitée à ces cas lorsque la concentration de particules virales dans le matériau clinique est suffisamment haute (10 5 en 1 mlet plus haut). L'inconvénient de la méthode est l'incapacité de distinguer les virus appartenant à un groupe taxonomique. Cet inconvénient est éliminé en utilisant une microscopie à l'électronique immunitaire. La méthode est basée sur la formation de complexes immunitaires lors de l'ajout de sérum spécifique aux particules virales, tandis que la concentration de particules virales se produit, ce qui vous permet de les identifier. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. Aux fins du diagnostic rapide, une étude microscopique électronique des extraits de tissus, des matières fécales, des fluides en vésicules, des secrets de la nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus, ses capacités sont élargies lorsque des anticorps étiquetés.
La méthode d'hybridation moléculaire basée sur l'identification des acides nucléiques spécifiques à un virus permet de détecter des copies unique des gènes et le degré de sensibilité n'est pas pertinent. La réaction est basée sur l'hybridation des fils complémentaires de l'ADN ou de l'ARN (sondes) et la formation de structures de liaison. La sonde la moins chère est l'ADN recombinant cloné. La sonde est faite par des précurseurs radioactifs (généralement phosphore radioactif). Utilisez de manière perspective des réactions colorimétriques. Il existe plusieurs variantes d'hybridation moléculaire: point hybridation des épaules, hybridation en sandwich, hybridation in situ, etc.
Les anticorps de classe LGM apparaissent plus tôt que les anticorps de classe G (au 3-5ème jour de la maladie) et disparaissent dans quelques semaines, leur détection indique donc simplement une infection souffrant. Les anticorps de classe LGM sont détectés par l'immunofluorescence ou en utilisant une analyse ennuno-immunimique à l'aide d'anti-μ-antiserums (sérum contre les chains lourds LGM).
Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur classique réactions immunologiques (Voir Méthodes de recherche immunologiques) : Complément de réactions de liaison, hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, immunoferment, analyse radioimmune. Les micrométéques de nombreuses réactions ont été développées, elles sont continuellement améliorées par elles. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et de sérodiagnostics afin de déterminer la croissance des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (premier sérum Prendre les premiers jours après la maladie, le second - après 2-3 semaines). Valeur diagnostique Il n'a pas moins de quatre augmentations d'anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection des anticorps de classe LGM indique une infection récemment subie, les anticorps de la classe LGC sont préservés pendant plusieurs années et parfois de la vie.
Pour identifier des antigènes individuels de virus et d'anticorps à des mélanges complexes sans protéines de nettoyage préliminaires, les immunoblotiques sont utilisées. La méthode combine la fractionnement des protéines à l'aide d'électrophorèse dans un gel de polyacrylamide, suivie d'une administration immunologique de protéines par une méthode d'immunotasse enzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de la pureté chimique de l'antigène et vous permet d'identifier des paires individuelles d'anticorps antigène. Une telle tâche est pertinente, par exemple, dans la sérodiagnostic de l'infection par le VIH, lorsque les fausses réactions positives de l'analyse immuno-immunimensionnelle sont dues à la présence d'anticorps à des antigènes cellulaires, qui sont présents à la suite d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification d'anticorps dans les patients sériques aux antigènes de virus interne et externe permet de déterminer le stade de la maladie et lors de l'analyse des populations - la variabilité des protéines virales. L'immunoblotement pour l'infection à VIH est utilisé comme un test confirmant pour identifier des antigènes viraux individuels et des anticorps. Lors de l'analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. La plus grande valeur de la méthode est la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie ADN recombinante, à la mise en place de leur taille et à la présence de déterminants antigéniques.
Le diagnostic de laboratoire d'infections virales comporte trois approches principales.
1) étude directe du matériau pour la présence d'antigène viral ou d'acides nucléiques;
2) isolation et identification du virus du matériau clinique;
Méthodes directes pour diagnostiquer le matériau clinique
Les méthodes directes sont des méthodes qui vous permettent de détecter un virus, un antigène viral ou un acide nucléique viral (NK) directement dans le matériau clinique, c'est-à-dire le plus rapide (2-24 h).
Microscopie électronique (EM). Avec cette méthode, vous pouvez détecter le virus réel.
microscopie à Electrone immunitaire (IEM), sous laquelle appliquée anticorps spécifiques aux virus. En raison de l'interaction des anticorps avec des virus, des complexes sont formés, ce qui est plus facile après des contrastes négatifs.
Réaction d'immunofluorescence (récif). La méthode est basée sur l'utilisation d'anticorps associés au colorant
La méthode de récif est largement utilisée pour déchiffrer rapidement l'étiologie des infections virales respiratoires pointues lors de l'analyse de la muqueuse imprimée de la partie supérieure. voies respiratoires.
Analyse d'enzyme immuno (ELISA). Les méthodes immuno-immunimales de détermination des antigènes viraux en principe sont similaires au récif, mais sont basées sur l'étiquette des anticorps par des enzymes et non des colorants.
Analyse radio-immune (RIA). La méthode est basée sur l'étiquette d'anticorps avec radio-isotrops, ce qui garantissait une sensibilité élevée pour déterminer l'antigène viral.
Méthodes moléculaires. Initialement, une méthode d'hybridation hautement spécifique du NK a été considérée comme la méthode classique d'identification du génome viral, mais toutes plus larges utilisent la libération des génomes de virus utilisant une réaction en chaîne de polymérase (PCR).
Hybridation moléculaire d'acides nucléiques. La méthode est basée sur l'hybridation de fils complémentaires d'ADN ou d'ARN avec la formation de structures de liaison et sur les identifier
La PCR est basée sur le principe de la réplication naturelle de l'ADN. L'essence de la méthode consiste à répéter les cycles de synthèse (amplification) de la séquence d'ADN spécifique du virus à l'aide de la stable thermique TAQ Polymérase et de deux graines spécifiques - les amorces dites.
Les méthodes cytologiques ont actuellement une valeur de diagnostic limitée, mais dans un certain nombre d'infections doivent encore être appliquées. Les matériaux d'autopsie, de biopsie, de traits, qui, après traitement approprié, sont peints et analysés au microscope sont étudiés.
Pour l'allocation réussie de virus, le matériel clinique doit être pris conformément à la pathogenèse de la maladie alléguée et à l'époque antérieure.
Typiquement, prenez:
- pli infections respiratoires - Nasoparynk lavé;
- pli infections entérovirus - lavage et matières fécales (re-, entérovirus);
- avec lésions de la peau et des muqueuses - zinc, le contenu des bulles (herpès, varicelle);
- pendant les tests infections - lavages (rougeole, rubéole);
- avec infections arbovirales - sang, fluide rachidien.
Les cultures cellulaires, les animaux de laboratoire, les embryons de poulets sont utilisés pour libérer des virus. Le processus est long, nécessitant parfois plusieurs passages avant que le virus ne soit détecté et identifié avec une ou plusieurs méthodes - dans la réaction de neutralisation (pH), le récif, l'IFA ou la PCR.
Sérodiagnostique
Diagnostic séricsSur la base de la réaction anticorps antigène, peut être utilisée pour déterminer les deux à la fois et joue un rôle dans la détermination de l'étiologie de l'infection virale, même avec des résultats négatifs de la libération du virus.
RSK est l'une des réactions sérologiques traditionnelles et est utilisée pour diagnostiquer de nombreuses infections virales. Deux systèmes sont impliqués dans la réaction: des anticorps sériques d'un patient + des cellules de virus standard et de sang rouge + des anticorps, ainsi que du complément à la retraite. Conformément aux anticorps et au virus, ce complexe se lie le complément et la lyse des érythrocytes d'agneau ne se produit pas ( réaction positive). Avec un RSK négatif, le complément contribue à la lyse des globules rouges. L'inconvénient de la méthode est sa sensibilité et difficulté insuffisamment élevées de la standardisation des réactifs. La méthode AIF ainsi qu'un ELISA est utilisé pour déterminer les anticorps sériques.
Méthodes de recherche virologique - Méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. La virologie est largement utilisée des méthodes de biologie moléculaire, à l'aide de laquelle la structure moléculaire des particules virales a réussi à établir la structure moléculaire, les procédés de les pénétrer dans la cellule et les particularités de la reproduction des virus, la structure primaire des acides nucléiques viraux et des protéines. Les méthodes de détermination de la séquence d'éléments de composants d'acides nucléiques viraux et d'acides aminés de protéines sont en développement. Il est possible d'associer les fonctions des acides nucléiques et des protéines codées avec la séquence nucléotidique et établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse d'une infection virale.
Les méthodes de recherche virologiques reposent également sur des processus immunologiques (interaction de l'antigène avec des anticorps), propriétés biologiques du virus (capacité d'hémagglutination, d'hémolyse, activité enzymatique), caractéristiques de l'interaction du virus avec la cellule hôte (la nature du effet cytopathique, la formation d'inclusions intracellulaires, etc.).
Dans le diagnostic d'infections virales, avec une culture, une isolation et une identification des virus, et le procédé de culture des tissus et des cellules est largement utilisé. Utilisation de cultures de cellules traduites et diploïdes primaires, secondaires, stables et diploïdes. Les cultures primaires sont obtenues en dispersant des tissus avec des enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase). La source de cellules peut être des tissus et des organes (plus souvent que les embryons des animaux. La suspension des cellules dans le milieu nutritif est placée dans les dossiers de matelas, de bouteilles ou de boîtes de Pétri, où, après la fixation de la surface du récipient, les cellules commencent à se multiplier. Pour l'infection, les virus utilisent généralement des monocouches cellulaires. Le fluide nutritif est versé, une suspension virale est introduite dans certaines dilutions et après contact avec les cellules, un milieu nutritif frais est ajouté, généralement sans sérum.
Les cellules de la majorité des cultures primaires peuvent être placées, une telle culture s'appelle secondaire. Dans l'autre passage de cellules, la population de cellules semblables à la fibroblaste capables de reproduction rapide est formée, dont la plupart conservent l'ensemble original de chromosomes. Ce sont les soi-disant cellules diploïdes. Avec la culture en série de cellules, des cultures de cellules stables sont obtenues. Les passages apparaissent des cellules homogènes rapidement divisées avec un ensemble hétéroploïde de chromosomes. Les lignes cellulaires stables peuvent être une couche simple et une suspension. Les cultures monocouche se développent sous la forme d'une couche solide sur la surface du verre, suspension - en tant que suspensions dans divers récipients utilisant des dispositifs d'agitation. Il existe plus de 400 lignes de cellules dérivées de 40 types d'animaux différents (y compris des primates, des oiseaux, des reptiles, des amphibiens, des poissons, des insectes) et des humains.
Dans les milieux nutritifs artificiels, il est possible de cultiver des morceaux d'organes et de tissus individuels (cultures d'organes). Ces types de cultures conservent la structure du tissu, qui est particulièrement importante pour l'allocation et le passage des virus qui ne sont pas reproduits dans des cultures tissulaires indifférenciées (par exemple, coronavirus).
Dans les cultures cellulaires infectées, des virus peuvent être détectés en modifiant la morphologie des cellules, l'effet cytopathique, qui peut être de nature spécifique, l'apparence d'inclusions, en déterminant des antigènes viraux dans la cellule et dans le fluide de culture; établir les propriétés biologiques de la progéniture virale dans le fluide culturel et la titrage des virus dans la culture des tissus, des embryons de poulet ou des animaux sensibles; En identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans les cellules par hybridation moléculaire ou grappes d'acides nucléiques par procédé cytochmique à l'aide de la microscopie fluorescente.
La sélection des virus est un processus fastidieux et long terme. Il est effectué afin de déterminer la circulation entre la population du type ou de la variante du virus (par exemple, d'identifier le virus de la grippe, la souche sauvage ou du vaccin du virus de la polio, etc.); Dans les cas où il est nécessaire pour les mesures épidémiologiques urgentes; Lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent; Si nécessaire, confirmez le diagnostic préliminaire; Indiquer des virus dans des objets environnementaux. Lorsque le virus isolé, ils tiennent compte de la possibilité de les persister dans le corps humain, ainsi que de la survenue d'une infection mixte causée par deux virus et plus de virus. Une population de virus génétiquement homogène obtenue d'un virion est appelée clone virale et le processus d'obtention est le clonage.
Pour la sélection de virus, une infection d'animaux de laboratoire sensibles, des embryons de poulet, sont utilisés, mais la culture tissulaire est la plus souvent utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symbolastes et de sympithies, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par les méthodes d'immunofluorescence, hémadémie, hémagglutination (dans les virus d'hémagglutinisation ), etc. Ces signes ne peuvent être détectés qu'après 2-3 passages du virus.
Pour mettre en évidence un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, l'utilisation des embryons de poulet, pour mettre en évidence certains virus de COKES et un certain nombre d'arbovirus - souris nouveau-nés. L'identification des virus sélectionnés est effectuée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes.
Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans la culture tissulaire, déterminant la plus grande dilution du fluide contenant du virus, dans laquelle la dégénérescence des tissus se produit et des antigènes spécifiques à virus sont formés. Pour titrer un certain nombre de virus, vous pouvez utiliser la méthode des plaques. Les plaques, ou les colonies négatives de virus sont des foyers détruits par le virus des cellules d'une culture de tissu unique sous un revêtement d'agar. Le calcul des colonies vous permet de quantifier l'activité infectieuse des virus au taux du calcul que une particule infectieuse du virus forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants de plomberie, généralement neutres; Les plaques n'adsorbent pas le colorant et donc visibles comme des taches légères sur le fond des cellules vivantes peintes. Le titre du virus est exprimé par le nombre d'unités de blanchiment dans 1 ml.
La purification et la concentration de virus sont généralement effectuées par ultracentrifugation différentielle, suivie d'une centrifugation dans des gradients de concentration ou de la densité. Les méthodes immunologiques, la chromatographie d'échange d'ions, les immunosorbants, etc. sont utilisées pour nettoyer les virus.
Les diagnostics de laboratoire d'infections virales incluent la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériau clinique; sélection du virus de ce matériau; Sérodiagnostique. Le choix de la méthode de diagnostic de laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la période de la maladie et des possibilités du laboratoire. Le diagnostic moderne d'infections virales est basé sur des méthodes rapides, permettant de recevoir une réponse quelques heures après avoir pris des matériaux cliniques au début de la maladie, il comprend une microscopie électronique et une microscopie électronique immunitaire, ainsi que l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire, la détection des anticorps de classe LGM et al.
La microscopie électronique des virus peints par une contraste négative vous permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic d'infections virales est limitée à ces cas lorsque la concentration de particules virales dans le matériau clinique est suffisamment haute (10 5 en 1 mlet plus haut). L'inconvénient de la méthode est l'incapacité de distinguer les virus appartenant à un groupe taxonomique. Cet inconvénient est éliminé en utilisant une microscopie à l'électronique immunitaire. La méthode est basée sur la formation de complexes immunitaires lors de l'ajout de sérum spécifique aux particules virales, tandis que la concentration de particules virales se produit, ce qui vous permet de les identifier. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. Aux fins du diagnostic rapide, une étude microscopique électronique des extraits de tissus, des matières fécales, des fluides en vésicules, des secrets de la nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus, ses capacités sont élargies lorsque des anticorps étiquetés.
La méthode d'hybridation moléculaire basée sur l'identification des acides nucléiques spécifiques à un virus permet de détecter des copies unique des gènes et le degré de sensibilité n'est pas pertinent. La réaction est basée sur l'hybridation des fils complémentaires de l'ADN ou de l'ARN (sondes) et la formation de structures de liaison. La sonde la moins chère est l'ADN recombinant cloné. La sonde est faite par des précurseurs radioactifs (généralement phosphore radioactif). Utilisez de manière perspective des réactions colorimétriques. Il existe plusieurs variantes d'hybridation moléculaire: point hybridation des épaules, hybridation en sandwich, hybridation in situ, etc.
Les anticorps de classe LGM apparaissent plus tôt que les anticorps de classe G (au 3-5ème jour de la maladie) et disparaissent dans quelques semaines, leur détection indique donc simplement une infection souffrant. Les anticorps de classe LGM sont détectés par immunofluorescence ou à l'aide d'une analyse immunologique enzymatique à l'aide d'une attaquante anti-M-attaquante (sérum contre lourd chains LGM).
Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir Méthodes de recherche immunologiques ): Complément de réactions de liaison, hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, analyse immunoformale. Les micrométéques de nombreuses réactions ont été développées, elles sont continuellement améliorées par elles. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et de sérodiagnostics afin de déterminer la croissance des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (premier sérum Prendre les premiers jours après la maladie, le second - après 2-3 semaines). La valeur de diagnostic n'a pas moins de quatre augmentations d'anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection des anticorps de classe LGM indique une infection récemment subie, les anticorps de la classe LGC sont préservés pendant plusieurs années et parfois de la vie.
Pour identifier des antigènes individuels de virus et d'anticorps à des mélanges complexes sans protéines de nettoyage préliminaires, les immunoblotiques sont utilisées. La méthode combine la fractionnement des protéines à l'aide d'électrophorèse dans un gel de polyacrylamide, suivie d'une administration immunologique de protéines par une méthode d'immunotasse enzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de la pureté chimique de l'antigène et vous permet d'identifier des paires individuelles d'anticorps antigène. Une telle tâche est pertinente, par exemple, dans la sérodiagnostic de l'infection par le VIH, lorsque les fausses réactions positives de l'analyse immuno-immunimensionnelle sont dues à la présence d'anticorps à des antigènes cellulaires, qui sont présents à la suite d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification d'anticorps dans les patients sériques aux antigènes de virus interne et externe permet de déterminer le stade de la maladie et lors de l'analyse des populations - la variabilité des protéines virales. L'immunoblotement pour l'infection à VIH est utilisé comme un test confirmant pour identifier des antigènes viraux individuels et des anticorps. Lors de l'analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. La plus grande valeur de la méthode est la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie ADN recombinante, à la mise en place de leur taille et à la présence de déterminants antigéniques.
Bibliographie: Buinskaya A.g. Virologie, M., 1986; Virologie, méthodes, éd. B. Meihi, par. de l'anglais, M., 1988; Répertoire des méthodes de recherche microbiologiques et virologiques, éd. M.o. Birger, M., 1982.
Méthodes de recherche virologique méthodes d'étude de la biologie des virus et de leur identification. La virologie est largement utilisée des méthodes de biologie moléculaire, à l'aide de laquelle la structure moléculaire des particules virales a réussi à établir la structure moléculaire, les procédés de les pénétrer dans la cellule et les particularités de la reproduction des virus, la structure primaire des acides nucléiques viraux et des protéines. Les méthodes de détermination de la séquence d'éléments de composants d'acides nucléiques viraux et d'acides aminés de protéines sont en développement. Il est possible d'associer les fonctions des acides nucléiques et des protéines codées avec la séquence nucléotidique et établir les causes des processus intracellulaires qui jouent un rôle important dans la pathogenèse d'une infection virale. Dans les cultures cellulaires infectées, des virus peuvent être détectés en modifiant la morphologie des cellules, l'effet cytopathique, qui peut être de nature spécifique, l'apparence d'inclusions, en déterminant des antigènes viraux dans la cellule et dans le fluide de culture; établir les propriétés biologiques de la progéniture virale dans le fluide culturel et la titrage des virus dans la culture des tissus, des embryons de poulet ou des animaux sensibles; En identifiant des acides nucléiques viraux individuels dans les cellules par hybridation moléculaire ou grappes d'acides nucléiques par procédé cytochmique à l'aide de la microscopie fluorescente. La sélection des virus est un processus fastidieux et long terme. Il est effectué afin de déterminer la circulation entre la population du type ou de la variante du virus (par exemple, d'identifier le virus de la grippe, la souche sauvage ou du vaccin du virus de la polio, etc.); Dans les cas où il est nécessaire pour les mesures épidémiologiques urgentes; Lorsque de nouveaux types ou variantes de virus apparaissent; Si nécessaire, confirmez le diagnostic préliminaire; Indiquer des virus dans des objets environnementaux. Lorsque le virus isolé, ils tiennent compte de la possibilité de les persister dans le corps humain, ainsi que de la survenue d'une infection mixte causée par deux virus et plus de virus. Une population de virus génétiquement homogène obtenue d'un virion est appelée clone virale et le processus d'obtention est le clonage. Pour la sélection de virus, une infection d'animaux de laboratoire sensibles, des embryons de poulet, sont utilisés, mais la culture tissulaire est la plus souvent utilisée. La présence d'un virus est généralement déterminée par une dégénérescence cellulaire spécifique (effet cytopathique), la formation de symbolastes et de sympithies, la détection d'inclusions intracellulaires, ainsi qu'un antigène spécifique détecté par les méthodes d'immunofluorescence, hémadémie, hémagglutination (dans les virus d'hémagglutinisation ), etc. Ces signes ne peuvent être détectés qu'après 2-3 passages du virus. Pour mettre en évidence un certain nombre de virus, tels que les virus de la grippe, l'utilisation des embryons de poulet, pour mettre en évidence certains virus de COKES et un certain nombre d'arbovirus - souris nouveau-nés. L'identification des virus sélectionnés est effectuée à l'aide de réactions sérologiques et d'autres méthodes. Lorsque vous travaillez avec des virus, leur titre est déterminé. Le titrage des virus est généralement effectué dans la culture tissulaire, déterminant la plus grande dilution du fluide contenant du virus, dans laquelle la dégénérescence des tissus se produit et des antigènes spécifiques à virus sont formés. Pour titrer un certain nombre de virus, vous pouvez utiliser la méthode des plaques. Les plaques, ou les colonies négatives de virus sont des foyers détruits par le virus des cellules d'une culture de tissu unique sous un revêtement d'agar. Le calcul des colonies vous permet de quantifier l'activité infectieuse des virus au taux du calcul que une particule infectieuse du virus forme une plaque. Les plaques sont détectées en colorant la culture avec des colorants de plomberie, généralement neutres; Les plaques n'adsorbent pas le colorant et donc visibles comme des taches légères sur le fond des cellules vivantes peintes. Le titre du virus est exprimé par le nombre d'unités de blanchiment dans 1 ml. La purification et la concentration de virus sont généralement effectuées par ultracentrifugation différentielle, suivie d'une centrifugation dans des gradients de concentration ou de la densité. Les méthodes immunologiques, la chromatographie d'échange d'ions, les immunosorbants, etc. sont utilisées pour nettoyer les virus. Les diagnostics de laboratoire d'infections virales incluent la détection de l'agent pathogène ou de ses composants dans le matériau clinique; sélection du virus de ce matériau; Sérodiagnostique. Le choix de la méthode de diagnostic de laboratoire dans chaque cas individuel dépend de la nature de la maladie, de la période de la maladie et des possibilités du laboratoire. Le diagnostic moderne d'infections virales est basé sur des méthodes rapides, permettant de recevoir une réponse quelques heures après avoir pris des matériaux cliniques au début de la maladie, il comprend une microscopie électronique et une microscopie électronique immunitaire, ainsi que l'immunofluorescence, la méthode d'hybridation moléculaire, la détection des anticorps de classe LGM et al. La microscopie électronique des virus peints par une contraste négative vous permet de différencier les virus et de déterminer leur concentration. L'utilisation de la microscopie électronique dans le diagnostic d'infections virales est limitée à ces cas lorsque la concentration de particules virales dans le matériau clinique est suffisamment haute (10 5 en 1 mlet plus haut). L'inconvénient de la méthode est l'incapacité de distinguer les virus appartenant à un groupe taxonomique. Cet inconvénient est éliminé en utilisant une microscopie à l'électronique immunitaire. La méthode est basée sur la formation de complexes immunitaires lors de l'ajout de sérum spécifique aux particules virales, tandis que la concentration de particules virales se produit, ce qui vous permet de les identifier. La méthode est également utilisée pour détecter des anticorps. Aux fins du diagnostic rapide, une étude microscopique électronique des extraits de tissus, des matières fécales, des fluides en vésicules, des secrets de la nasopharynx est effectué. La microscopie électronique est largement utilisée pour étudier la morphogenèse du virus, ses capacités sont élargies lorsque des anticorps étiquetés. La méthode d'hybridation moléculaire basée sur l'identification des acides nucléiques spécifiques à un virus permet de détecter des copies unique des gènes et le degré de sensibilité n'est pas pertinent. La réaction est basée sur l'hybridation des fils complémentaires de l'ADN ou de l'ARN (sondes) et la formation de structures de liaison. La sonde la moins chère est l'ADN recombinant cloné. La sonde est faite par des précurseurs radioactifs (généralement phosphore radioactif). Utilisez de manière perspective des réactions colorimétriques. Il existe plusieurs variantes d'hybridation moléculaire: point hybridation des épaules, hybridation en sandwich, hybridation in situ, etc. Les anticorps de classe LGM apparaissent plus tôt que les anticorps de classe G (au 3-5ème jour de la maladie) et disparaissent dans quelques semaines, leur détection indique donc simplement une infection souffrant. Les anticorps de classe LGM sont détectés par l'immunofluorescence ou en utilisant une analyse ennuno-immunimique à l'aide d'anti-μ-antiserums (sérum contre les chains lourds LGM). Les méthodes sérologiques en virologie sont basées sur des réactions immunologiques classiques (voir Méthodes de recherche immunologiques) :
Complément de réactions de liaison, hémagglutination, neutralisation biologique, immunodiffusion, hémagglutination indirecte, hémolyse radiale, immunofluorescence, analyse immunoformale. Les micrométéques de nombreuses réactions ont été développées, elles sont continuellement améliorées par elles. Ces méthodes sont utilisées pour identifier les virus à l'aide d'un ensemble de sérums connus et de sérodiagnostics afin de déterminer la croissance des anticorps dans le deuxième sérum par rapport au premier (premier sérum Prendre les premiers jours après la maladie, le second - après 2-3 semaines). La valeur de diagnostic n'a pas moins de quatre augmentations d'anticorps dans le deuxième sérum. Si la détection des anticorps de classe LGM indique une infection récemment subie, les anticorps de la classe LGC sont préservés pendant plusieurs années et parfois de la vie. Pour identifier des antigènes individuels de virus et d'anticorps à des mélanges complexes sans protéines de nettoyage préliminaires, les immunoblotiques sont utilisées. La méthode combine la fractionnement des protéines à l'aide d'électrophorèse dans un gel de polyacrylamide, suivie d'une administration immunologique de protéines par une méthode d'immunotasse enzymatique. La séparation des protéines réduit les exigences de la pureté chimique de l'antigène et vous permet d'identifier des paires individuelles d'anticorps antigène. Une telle tâche est pertinente, par exemple, dans la sérodiagnostic de l'infection par le VIH, lorsque les fausses réactions positives de l'analyse immuno-immunimensionnelle sont dues à la présence d'anticorps à des antigènes cellulaires, qui sont présents à la suite d'une purification insuffisante des protéines virales. L'identification d'anticorps dans les patients sériques aux antigènes de virus interne et externe permet de déterminer le stade de la maladie et lors de l'analyse des populations - la variabilité des protéines virales. L'immunoblotement pour l'infection à VIH est utilisé comme un test confirmant pour identifier des antigènes viraux individuels et des anticorps. Lors de l'analyse des populations, la méthode est utilisée pour déterminer la variabilité des protéines virales. La plus grande valeur de la méthode est la possibilité d'analyser les antigènes synthétisés à l'aide de la technologie ADN recombinante, à la mise en place de leur taille et à la présence de déterminants antigéniques. Bibliographie: Buinskaya A.g. Virologie, M., 1986; Virologie, méthodes, éd. B. Meihi, par. de l'anglais, M., 1988; Répertoire des méthodes de recherche microbiologiques et virologiques, éd. M.o. Birger, M., 1982.
1. Malaya encyclopédie médicale. - M.: Encyclopédie médicale. 1991-96 2. Premier soins de santé. - M.: Grande encyclopédie russe. 1994 3. Dictionnaire encyclopédique termes médicaux. - M.: Encyclopédie soviétique. - 1982-1984.
- Virusculaire
- Virologie
Regardez ce qui est "Méthodes de recherche virologique" dans d'autres dictionnaires:
Recherche virologique - Il est destiné à détecter les virus, leur identification (identification) et l'étude des propriétés biologiques. Pour mettre en évidence les virus (voir les virus) des humains, des animaux et des plantes, le matériau à l'étude est introduit dans le corps des virus sensibles ... ... Grande Encyclopédie soviétique
Recherche virologique - des études virologiques, un complexe de méthodes de recherche qui vous permettent de reconnaître l'étiologie maladie virale et étudier son agent pathogène. Les étapes de base de V. et. sont la sélection du virus des patients et des animaux tombés (prise, conserve ... Dictionnaire encyclopédique vétérinaire
Recherche de laboratoire - Recherche de laboratoire. Voir la recherche de laboratoire. La condition la plus importante pour obtenir des résultats de recherche fiables est bon choix Les objets d'analyse, leur sélection rapide et leur formulation de la tâche de l'étude. Règles d'échantillonnage ... Maladies de poisson: Annuaire
Laboratoires médicaux - Institutions du système de santé ou des divisions structurelles des institutions préventives thérapeutiques préventives ou sanitaires destinées à diverses recherche médicale. Ce groupe n'inclut pas scientifiquement ... ... Encyclopédie médicale
Épidémiologie - J'épidémiologie (épidémie + grecque. Logos Doctrine) Science, qui étudie les schémas du processus épidémique et en développant des mesures pour lutter contre les maladies humaines contagieuses. Historiquement, E. s'est développé comme une discipline scientifique, l'objet d'étude qui ... ... Encyclopédie médicale
Virologie - Je virgologie (virus [S] (virus) + grec. Logos Doctrine) MEDICO biologieétudier les virus. Originaire à la fin du XIXe siècle, lorsque le scientifique russe D.I. Ivanovsky (1892) Pour la première fois, fixez l'existence des plus petits microorganismes qui causent ... ... Encyclopédie médicale
Encéphalite Kleshchev - (Synonymes: encéphalomyélite de tic-tique, encéphalite d'été de printemps, printemps été méningoencéphalite, encéphalite de la taïga, encéphalite d'extrême orientale russe) maladie infectieusecaractérisé par la fièvre, l'intoxication et assez lésion… … Encyclopédie médicale